甜瓜α-甘露糖苷酶基因的克隆、表達(dá)特性及功能分析.pdf

1、甜瓜是具有重要商業(yè)價值的園藝作物，對于消費者來說，它的品質(zhì)是一個重要的質(zhì)量屬性。甜瓜果實中含有香味揮發(fā)物、可溶性糖、有機(jī)酸、色素、次生代謝物等，可以提供很多人類的日常飲食營養(yǎng)，因此受到人們的喜愛。甜瓜果實不耐貯運，貨架期相對較短，在運輸和銷售過程中伴隨著果實的成熟和軟化，損失加劇。而且，采摘后果實過度軟化引起皺縮、干燥和霉變，嚴(yán)重降低了甜瓜果實的質(zhì)量和感觀性狀。
　　α-甘露糖苷酶（α-mannosidase）是一類關(guān)鍵性糖苷酶，

2、由很多成員組成。它的功能是修剪糖蛋白糖鏈中的不同甘露糖基，它不僅在糖蛋白的形成過程中發(fā)揮重要作用，并且參與果實的成熟與軟化。
　　為了研究甜瓜α-甘露糖苷酶基因（α-Man）在果實發(fā)育成熟中的功能，本論文以甜瓜品種河套蜜瓜為研究材料，克隆了甜瓜果實中的α-Man基因全長cDNA。測定了甜瓜根、莖、葉、子房等不同組織和不同發(fā)育時期的果實中α-甘露糖苷酶活性，結(jié)果表明在子房中的酶活性最低，根、莖、葉組織中的酶活性較高，約為子房中活性的

3、3～5倍。授粉后10～30d的果實中，其活性顯著下降，而授粉后40d果實果皮顏色變黃，其活性有所增加。RT-qPCR分析結(jié)果顯示，α-Man基因在葉片中的表達(dá)量最高，子房中表達(dá)量最低，葉片中表達(dá)量約為子房中的表達(dá)量的6倍，授粉后10～30dα-Man基因表達(dá)量顯著下降，而授粉后40d果皮顏色變黃，其表達(dá)量有所回升。
　　利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的瞬時表達(dá)技術(shù)，分別將含α-Man基因的超表達(dá)載體pPZP221-Man、RNAi載體pART-M

4、an1和pART-Man2的農(nóng)桿菌菌液注射至成熟期甜瓜果實，進(jìn)行瞬時表達(dá)，并對其進(jìn)行了表達(dá)特性分析。3～5天時，注射超表達(dá)載體菌液的果實在注射部位出現(xiàn)了提前變黃的表型。5～7天時，注射RNAi載體菌液的果實在注射部位仍保持綠色（推遲變黃）。α-甘露糖苷酶活性測定結(jié)果顯示，與非注射部位相比，注射超表達(dá)載體的組織α-甘露糖苷酶活性較高，而注射RNAi載體的組織α-甘露糖苷酶活性較低。RT-qPCR分析表明，在瞬時超表達(dá)α-Man基因的果實組

5、織中，α-Man基因和ACS6等成熟相關(guān)基因表達(dá)水平增高，而在瞬時抑制α-Man基因表達(dá)的果實組織中，這些基因表達(dá)水平有所下降，表明α-Man基因具有促進(jìn)果實成熟的功能。
　　應(yīng)用花粉管通道法轉(zhuǎn)化技術(shù)，分別將pPZP221-Man(Oe-Man)和pART-Man1(Ri-Man)載體導(dǎo)入甜瓜，經(jīng)PCR檢測證明外源基因已經(jīng)整合到受體植物的基因組中，分別獲得了T1代和T2代轉(zhuǎn)基因植株。與未轉(zhuǎn)基因?qū)φ仗鸸舷啾?，轉(zhuǎn)Oe-Man T1代甜