草魚PKR基因的克隆、表達特性及功能分析.pdf

1、先天性免疫(innate immunity)是生物體快速識別和抵抗入侵病原微生物的第一道防線，在控制病原體在體內(nèi)擴散和清除體內(nèi)病原體方面起著重要作用。干擾素是機體先天性免疫抵抗病毒侵染的重要組成成分，它通過激活干擾素刺激基因(ISGs)誘導(dǎo)多種抗病毒蛋白的表達來實現(xiàn)抗病毒作用，目前研究較多的抗病毒蛋白主要包括雙鏈RNA激活的蛋白激酶(PKR)、2'，5'-寡聚腺苷酸合成酶(2'，5'OAS)、核糖核酸酶L(RNase L)、RNA特異性

2、腺苷酸脫氨酶(ADAR)和抗粘液病毒蛋白(Mx)。其中PKR是IFN抗病毒作用過程中最重要的效應(yīng)蛋白之一。
　　 本文通過同源克隆和RACE技術(shù)得到了草魚PKR(CiPKR，JX511974)基因，其全長eDNA為2436bp，包括5'非翻譯區(qū)(5'UTR)170bp，3'非翻譯區(qū)(3'UTR)199bp，最大開放閱讀框(Open Reading Frame，ORF)2067bp，其中ORF編碼一個688aa的蛋白質(zhì)。預(yù)測的蛋白

3、分析顯示，CiPKR的N-端包含3個串聯(lián)的雙鏈RNA結(jié)合序列(dsRBMs)，C-端為保守的絲氨酸/蘇氨酸激酶區(qū)。系統(tǒng)樹顯示CiPKR與鯽魚PKR(CaPKR)和斑馬魚PKR(DrPKR)具有高度的同源性。CiPKR在草魚各組織和草魚腎細胞(CIK)中都有低水平的組成型表達，但是Poly I(:)C處理后就有明顯的上調(diào)表達。
　　 為了進一步了解CiPKR的功能，單獨克隆了其3個dsRBMs，連接至表達載體pET-32a，親和層

4、析獲得各個純化的融合多肽(PdsRBMs)，然后通過12％非變性PAGE電泳研究其二聚化的能力，結(jié)果顯示3個dsRBMs都能形成二聚體，但是聚合程度不同。同時，將pcDNA3.1/PKR系列重組質(zhì)粒和PGL-3-promoter質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至草魚腎細胞(CIK)發(fā)現(xiàn)CiPKR能明顯的抑制螢光素酶蛋白的表達;另一方面，將pcDNA3.1/PKR系列重組質(zhì)粒單轉(zhuǎn)至CIK后，用MTT的方法檢測細胞活性，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染CiPKR的情況下細胞活性明顯降低