柞蠶防御基因defense的克隆、表達與功能分析.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、免疫反應分為兩個分支,先天性免疫和獲得性免疫,昆蟲不具備哺乳動物那樣完善的獲得性免疫系統(tǒng),因此先天免疫就成為了其抵抗病原微生物入侵的主要手段,而昆蟲的先天免疫又分為細胞免疫和體液免疫兩大部分,二者共同作用抵御病原物的侵染。細胞免疫包括吞噬、集結(jié)和包囊等作用類型,同時體液免疫主要包括黑色素形成和抗菌肽產(chǎn)生兩種機制。柞蠶是一種重要的野生絹絲昆蟲,主要分布區(qū)域分別在亞洲國家,具有可以作為紡織工業(yè)原料利用的價值,而且具備很高的藥用和食用經(jīng)濟價值

2、,因此,對柞蠶先天免疫防御相關(guān)基因的研究對于提高柞蠶抗病能力具有重要的理論意義,此外,也可以推進鱗翅目其他昆蟲相關(guān)研究,從而進一步為鱗翅目病蟲害的防治提供借鑒。
  利用分子生物學和生物信息學方法對柞蠶defense基因進行分析研究,得到的主要研究成果有以下幾點:
  1.ApDef基因的克隆及序列分析:
  通過實驗克隆出ApDef基因的 cDNA序列,總長677bp,包括編碼163個氨基酸的開放閱讀框(ORF),以

3、及5’端非編碼區(qū)(5’UTR)和3’端非編碼區(qū)(3’UTR)分別為63bp和122bp。預測蛋白分子量約為17 kDa,理論等電點為4.74;該蛋白屬于親水性蛋白,有明顯的信號肽,沒有明顯的跨膜結(jié)構(gòu)域,且亞細胞定位在線粒體或其它部位的可能性很小,位于胞外的可能性最大。構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹顯示柞蠶與天蠶親緣關(guān)系最近,與哺乳動物人和小鼠的距離較遠。
  2. ApDef基因的表達分析:
  提取柞蠶五齡時期不同組織總RNA,設(shè)計特異

4、性引物,進行了實時熒光定量PCR(QRT-PCR)。實驗結(jié)果顯示,選取的組織表達量有明顯差異,在脂肪體中表達量最高,血細胞和中腸中有微量表達,表皮中不表達。
  PCR擴增柞蠶ApDef基因的ORF,連接到pET-28a(+)表達載體,并且轉(zhuǎn)入大腸桿菌 BL21(DE3)菌株中,用 IPTG進行了不同濃度的誘導表達,用SDS-PAGE電泳和 Western blot方法檢測驗證,表明被誘導的目的蛋白均得到了穩(wěn)定的表達。用IPTG進

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