柞蠶防御基因defense的克隆、表達(dá)與功能分析.pdf

1、免疫反應(yīng)分為兩個(gè)分支，先天性免疫和獲得性免疫,昆蟲不具備哺乳動(dòng)物那樣完善的獲得性免疫系統(tǒng),因此先天免疫就成為了其抵抗病原微生物入侵的主要手段，而昆蟲的先天免疫又分為細(xì)胞免疫和體液免疫兩大部分，二者共同作用抵御病原物的侵染。細(xì)胞免疫包括吞噬、集結(jié)和包囊等作用類型，同時(shí)體液免疫主要包括黑色素形成和抗菌肽產(chǎn)生兩種機(jī)制。柞蠶是一種重要的野生絹絲昆蟲，主要分布區(qū)域分別在亞洲國(guó)家，具有可以作為紡織工業(yè)原料利用的價(jià)值，而且具備很高的藥用和食用經(jīng)濟(jì)價(jià)值

2、，因此，對(duì)柞蠶先天免疫防御相關(guān)基因的研究對(duì)于提高柞蠶抗病能力具有重要的理論意義，此外，也可以推進(jìn)鱗翅目其他昆蟲相關(guān)研究，從而進(jìn)一步為鱗翅目病蟲害的防治提供借鑒。
　　利用分子生物學(xué)和生物信息學(xué)方法對(duì)柞蠶defense基因進(jìn)行分析研究，得到的主要研究成果有以下幾點(diǎn)：
　　1．ApDef基因的克隆及序列分析：
　　通過實(shí)驗(yàn)克隆出ApDef基因的 cDNA序列，總長(zhǎng)677bp，包括編碼163個(gè)氨基酸的開放閱讀框（ORF），以

3、及5’端非編碼區(qū)(5’UTR)和3’端非編碼區(qū)(3’UTR)分別為63bp和122bp。預(yù)測(cè)蛋白分子量約為17 kDa，理論等電點(diǎn)為4.74；該蛋白屬于親水性蛋白，有明顯的信號(hào)肽，沒有明顯的跨膜結(jié)構(gòu)域，且亞細(xì)胞定位在線粒體或其它部位的可能性很小，位于胞外的可能性最大。構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示柞蠶與天蠶親緣關(guān)系最近，與哺乳動(dòng)物人和小鼠的距離較遠(yuǎn)。
　　2. ApDef基因的表達(dá)分析：
　　提取柞蠶五齡時(shí)期不同組織總RNA，設(shè)計(jì)特異

4、性引物，進(jìn)行了實(shí)時(shí)熒光定量PCR（QRT-PCR）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，選取的組織表達(dá)量有明顯差異，在脂肪體中表達(dá)量最高，血細(xì)胞和中腸中有微量表達(dá)，表皮中不表達(dá)。
　　PCR擴(kuò)增柞蠶ApDef基因的ORF，連接到pET-28a(+)表達(dá)載體，并且轉(zhuǎn)入大腸桿菌 BL21(DE3)菌株中，用 IPTG進(jìn)行了不同濃度的誘導(dǎo)表達(dá)，用SDS-PAGE電泳和 Western blot方法檢測(cè)驗(yàn)證，表明被誘導(dǎo)的目的蛋白均得到了穩(wěn)定的表達(dá)。用IPTG進(jìn)