白菜花發(fā)育相關(guān)基因BcNS的克隆、表達(dá)與功能分析.pdf

1、蕓薹屬是十字花科植物的重要類群，也是我國(guó)栽培面積最大的蔬菜作物類群。白菜(BrassicacampestrisL.ssp.chinensis Makino)是蕓薹屬蕓薹種的一個(gè)亞種，是典型的異花授粉作物，具有顯著的雜種優(yōu)勢(shì)，F(xiàn)0代雜種的推廣應(yīng)用可以提高白菜的生產(chǎn)水平。雄性不育材料在白菜F1代種子的生產(chǎn)中具有重要地位，其選育和利用日益受到人們的重視。以白菜雄性不育材料為基礎(chǔ)，分析白菜花發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)特征，分離花發(fā)育相關(guān)基因并驗(yàn)證基因的

2、功能，不僅可以促進(jìn)白菜雄性不育材料的選育，而且對(duì)于揭示植物花發(fā)育的分子機(jī)制也具有重要的理論意義。
　　 本實(shí)驗(yàn)室采用ATH1芯片分析了授粉受精前后雌蕊基因的表達(dá)差異，發(fā)現(xiàn)At2g39060在授粉后的雌蕊中上調(diào)表達(dá)，同時(shí)我們也發(fā)現(xiàn)該基因在白菜mmc對(duì)應(yīng)的野生型中上調(diào)表達(dá)。At2g39060編碼的蛋白質(zhì)是一個(gè)MtN3/saliva家族蛋白，該基因在擬南芥中的功能還是未知。為了認(rèn)識(shí)該基因的結(jié)構(gòu)和表達(dá)特征，為進(jìn)一步研究其功能打下基礎(chǔ)，本

3、研究利用cDNA末端快速擴(kuò)增(rapid amplification of cDNA ends，RACE)技術(shù)和同源擴(kuò)增的方法克隆基因全長(zhǎng)，分析其序列特征并預(yù)測(cè)其蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能，進(jìn)而采用實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(real-time quantitative polymerase chain reaction，qRT-PCR)分析其在可育株和不育株的不同發(fā)育階段的花蕾中和營(yíng)養(yǎng)器官中的表達(dá)情況，采用組織原位雜交進(jìn)行該基因的細(xì)胞定位，預(yù)測(cè)其與

4、花發(fā)育的關(guān)系，同時(shí)構(gòu)建反義RNA表達(dá)載體，通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化菜心植株，比較分析轉(zhuǎn)基因植株和對(duì)照植株在形態(tài)、育性、花器結(jié)構(gòu)、花粉形態(tài)及萌發(fā)能力等方面的差異，為闡明該基因的生物學(xué)功能提供實(shí)驗(yàn)證據(jù)。取得的主要成果如下：
　　 (1)從ATH1基因芯片獲得的一個(gè)在白菜核雄性不育兩用系‘Bcajh97-01A/B’可育株和授粉后雌蕊中同時(shí)上調(diào)表達(dá)的基因At2g39060入手，利用同源擴(kuò)增和RACE技術(shù)成功克隆出它在白菜中的同源基因cDN

5、A全長(zhǎng)，命名為白菜蜜腺雄蕊發(fā)育基因(BrassicacampestrisNectaryStamen，BcNS)。該基因的DNA全長(zhǎng)為1603堿基對(duì)(basepair，bp)，cDNA全長(zhǎng)為1069bp，利用cluStalX軟件比較該基因的cDNA和DNA序列，發(fā)現(xiàn)該基因含有6個(gè)外顯子和5個(gè)內(nèi)含子，內(nèi)含子長(zhǎng)度分別為188bp、84bp、92bp、94bp和76bp，6個(gè)外顯子的長(zhǎng)度分別為49bp、37bp、211bp、162bp、120b

6、p和234bp，外顯子一內(nèi)含子交接處符合GT-AG規(guī)律，符合典型的植物內(nèi)含子剪切模式。BcNS的cDNA序列中，最大開(kāi)放閱讀框(Openreadingframe，ORF)為813bp，起始密碼子ATG始于第16位，終止密碼子TGA止于第828位，5’和3’非翻譯區(qū)分別為15bp和241bp，預(yù)測(cè)該基因可編碼一個(gè)含有270個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)。BcNS蛋白質(zhì)分子量為30110.08Daltons，等電點(diǎn)為9.117，pH7.0時(shí)的電荷為7.4

7、53，包含堿性氨基酸(K、R)21個(gè)，酸性氨基酸(D、E)14個(gè)，疏水氨基酸(A、I、L、F、W、V)124個(gè)，極性氨基酸(N、C、Q、S、T、Y)70個(gè)。該蛋白具有2個(gè)N-糖基化位點(diǎn)，1個(gè)依賴于cAMP和cGMP的蛋白激酶磷酸化位點(diǎn)，1個(gè)酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點(diǎn)，2個(gè)N-豆蔻酰化位點(diǎn)，4個(gè)蛋白激酶C(proteinkinaseC，PKC)磷酸化位點(diǎn)，1個(gè)Big-1(bacterialIg-likedomain1)結(jié)構(gòu)域位點(diǎn)，2個(gè)MtN3

8、/saliva家族位點(diǎn)。該基因的推測(cè)蛋白在N端由一段信號(hào)肽，信號(hào)肽和成熟肽之間的可能切割位點(diǎn)在第26和第27個(gè)氨基酸之間，有7個(gè)跨膜區(qū)，PSOR工程序定位該基因在細(xì)胞內(nèi)該蛋白為分泌途徑蛋白的可能性最高。
　　 (2)實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qRT-PCR)和原位雜交技術(shù)分析BcNS的時(shí)空表達(dá)表明，該基因用在‘Bajh97-01A/B’不育株和可育株的五級(jí)花蕾和開(kāi)放的花中檢測(cè)到了該基因的表達(dá)，開(kāi)放花中的表達(dá)量明顯高于第5級(jí)花蕾，其

9、它時(shí)期沒(méi)有檢測(cè)到表達(dá)。另外，該基因主要在不育株與可育株的蜜腺和雄蕊中表達(dá)，在花瓣和萼片中的表達(dá)量極低，在雌蕊中沒(méi)有表達(dá)。其中，該基因在不育株與可育株的雄蕊中的表達(dá)量相差無(wú)幾，幾乎相等，但是表達(dá)量都不高。而在蜜腺中的表達(dá)量非常高，大約是雄蕊中表達(dá)量的26～47倍，同時(shí)，該基因可育株中蜜腺的表達(dá)量大約是不育株中的1.7倍?；ㄆ鞴僦械谋磉_(dá)情況說(shuō)明該基因在蜜腺和雄蕊中特異表達(dá)，但是不育系和可育系中的表達(dá)量差別也并不大，說(shuō)明該基因與白菜的育性并沒(méi)