白菜花粉發(fā)育和授粉受精相關(guān)基因的表達(dá)分析與功能驗(yàn)證.pdf

1、花粉發(fā)育和授粉受精是植物生命周期中的重要環(huán)節(jié)，直接關(guān)系到蔬菜等農(nóng)作物的產(chǎn)量高低、質(zhì)量好壞、種子多少和品質(zhì)優(yōu)劣等?；ǚ郯l(fā)育和授粉受精過程的機(jī)制極其復(fù)雜，涉及眾多基因的表達(dá)與調(diào)控。目前對這兩個(gè)過程的已有研究成果尚不足以全面深入認(rèn)識該過程。同時(shí)從轉(zhuǎn)錄組水平、轉(zhuǎn)錄后調(diào)控及基因表達(dá)與功能驗(yàn)證等三個(gè)方面對花粉發(fā)育和授粉受精進(jìn)行分析，將為認(rèn)識這兩個(gè)相互獨(dú)立又緊密聯(lián)系的過程的分子調(diào)控機(jī)制提供入口和契機(jī)，具有十分重要的理論意義和應(yīng)用價(jià)值。
　　

2、本文以白菜（Brassica campestris L.ssp.chinensis Makino，syn.B.rapa ssp.chinensis）‘矮腳黃’核不育（‘Aijiaohuang’genic male sterility, ajhGMS）兩用系‘Bcajh97-01A/B'、‘Polima’核質(zhì)互作不育(polimagenic-cytoplasmic male sterility, polG-CMS)系‘Bcpol97-05

3、A’以及‘Ogura’細(xì)胞質(zhì)不育(ogura cytoplasmicmale sterility, oguCMS)系‘Bcogu97-06A’為材料，在通過授粉實(shí)驗(yàn)確定白菜‘矮腳黃’授粉受精過程的不同階段及其所經(jīng)歷的時(shí)間的基礎(chǔ)上，采用擬南芥全基因組表達(dá)譜芯片(GeneChip(R) ArabidopsisATH1 genome array，ATH1)分析‘Bcajh97-01A’授粉前后雌蕊的轉(zhuǎn)錄組差異;繼而對Bcajh97-01A’授

4、粉前后的雌蕊，以及3個(gè)不育系及其共享保持系的花序進(jìn)行microRNA(miRNA)的表達(dá)差異分析，篩選白菜中與花粉發(fā)育及授粉受精相關(guān)的miRNA;隨后，對兩個(gè)類果膠酸裂解酶基因Brassicacampestris pectate lyase like9(BcPLL9)、BcPLL10及一個(gè)新基因Brassica campestris male fertile21（Bc MF21）進(jìn)行結(jié)構(gòu)、表達(dá)、進(jìn)化等分析，并采用反義RNA技術(shù)對其分別受

5、抑制后的轉(zhuǎn)基因芽系進(jìn)行形態(tài)學(xué)、分子生物學(xué)、細(xì)胞學(xué)等鑒定，分析其在白菜花粉發(fā)育和授粉受精中的作用機(jī)制。取得的主要結(jié)果與結(jié)論如下:
　　 (1)植株形態(tài)和細(xì)胞學(xué)觀察結(jié)果表明白菜授粉受精過程可劃分為4個(gè)特征時(shí)期。以ajhGMS不育株系‘Bcajh97-01A’為母本，可育株系‘Bcajh97-01B'為父本，觀察授粉后，花粉在柱頭萌發(fā)和在花柱中的生長情況。其授粉受精過程表現(xiàn)出4個(gè)特征時(shí)期，其中時(shí)期Ⅰ(0～2 HAP)為花粉粘附、吸水和

6、萌發(fā)，即花粉萌發(fā)期;時(shí)期Ⅱ(2～4 HAP)為花粉管在花柱中生長;時(shí)期Ⅲ(4～16 HAP)為花粉管在子房中生長，發(fā)生受精，即花粉管生長和受精期;時(shí)期Ⅳ(16～24 HAP)為胚胎發(fā)育早期。
　　 (2)通過ATH1芯片分析，比較白菜授粉前后雌蕊轉(zhuǎn)錄組的差異，發(fā)現(xiàn)了77個(gè)授粉前后差異表達(dá)基因;將其與花粉發(fā)育相關(guān)基因進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)了10個(gè)花粉發(fā)育和授粉受精持續(xù)表達(dá)白菜同源基因。通過擬南芥ATH1芯片分析白菜‘Bcajh97-01A

7、’授粉前后雌蕊轉(zhuǎn)錄組差異，在授粉后雌蕊中檢測到44個(gè)上調(diào)表達(dá)和33個(gè)下調(diào)表達(dá)的基因，對它們進(jìn)行功能分類發(fā)現(xiàn)上調(diào)表達(dá)基因中有20％與細(xì)胞壁代謝相關(guān)。通過授粉受精相關(guān)基因與前人報(bào)導(dǎo)的花粉發(fā)育相關(guān)基因進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)At2g02720等10個(gè)基因在花粉發(fā)育和授粉受精過程均表達(dá)上調(diào)，表現(xiàn)出持續(xù)表達(dá)。并且這10個(gè)基因中有7個(gè)與細(xì)胞壁發(fā)育相關(guān)，其中包含兩個(gè)PLL基因(At2g02720，PLL9和At3g01270，PLL10)。
　　 (3

8、)白菜3個(gè)雄性不育系與其共同保持系花序的miRNA表達(dá)差異分析，表明不同遺傳模式不育系花序miRNA表達(dá)具有相似性。利用植物microRNAμParafloTM微流體芯片（miRNA芯片）對白菜ajhGMS‘Bcajh97-01A’、polG-CMS' Bcpol97-05A’和oguCMS' Bcogu97-06A’及它們共同的保持系‘ Bcajh97-01B’的花序進(jìn)行miRNA表達(dá)的比較分析，在‘Bcajh97-01A’與‘Bca

9、jh97-01B'花序中檢測到屬于7個(gè)miRNA家族的差異表達(dá)的miRNA為11個(gè);在‘Bcpol97-05A’與‘Bcajh97-01B'花序中檢測到屬于23個(gè)miRNA家族的差異表達(dá)的miRNA為64個(gè);在‘Bcogu97-06A’與‘Bcajh97-01B'花序中檢測到屬于20個(gè)miRNA家族的差異表達(dá)的miRNA為70個(gè)。其中，在3個(gè)不育系中共同下調(diào)表達(dá)的miRNA基因家族有1個(gè)(miR894)、上調(diào)表達(dá)的有2個(gè)（miR172和

10、miR399）。‘Bcajh97-01A’和‘Bcpol97-05A’共同下調(diào)和上調(diào)表達(dá)miRNA家族分別為1個(gè)和4個(gè);‘Bcajh97-01A’和‘Bcogu97-06A’共同下調(diào)和上調(diào)的miRNA分別為1個(gè)和2個(gè);‘Bcpol97-05A’和‘Bcogu97-06A’共同下調(diào)和共同上調(diào)表達(dá)的miRNA分別為8個(gè)和7個(gè)。這些結(jié)果表明不同遺傳模式不育系花序miRNA表達(dá)具有相似性。采用miRNA芯片對白菜‘Bcajh97-01A’授粉前

11、后的雌蕊進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)屬于4個(gè)miRNA家族的6個(gè)miRNA下調(diào)表達(dá)，屬于4個(gè)miRNA家族的16個(gè)miRNA上調(diào)表達(dá)。將授粉受精相關(guān)miRNA與花粉發(fā)育相關(guān)miRNA進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)有6個(gè)miRNA家族（miR896、miR1450、miR172、miRNA168、miR396和miR158）在兩個(gè)過程均差異表達(dá)。通過對所有檢測獲得的差異表達(dá)miRNA進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)參與花粉發(fā)育或授粉受精的非冗余miRNA共30個(gè)。通過查找已發(fā)表的數(shù)據(jù)發(fā)

12、現(xiàn)，在它們中，有近70％曾被報(bào)導(dǎo)在花粉中表達(dá)。
　　 (4)通過基因表達(dá)和功能分析，發(fā)現(xiàn)花粉和雌蕊特異表達(dá)的類果膠酸裂解酶基因BcPLL9與花粉壁內(nèi)壁相關(guān)。采用同源克隆的方法獲得白菜類果膠酸裂解酶基因BcPLL9的cDNA和DNA全長，核酸結(jié)構(gòu)和氨基酸結(jié)構(gòu)分析表明其具有果膠酸裂解酶基因的特征。qRT-PCR和組織原位雜交分析表明BcPLL9的轉(zhuǎn)錄本在成熟花粉粒、雌蕊的柱頭、花柱上部中表達(dá)。采用反義RNA技術(shù)抑制BcPLL9的表達(dá)

13、后，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株的花粉活力部分下降，當(dāng)花粉體外萌發(fā)時(shí)，花粉管生長無力，管壁處于松散的狀態(tài)，不像對照那樣緊貼花粉管質(zhì)膜;花粉管生長長度變短。形態(tài)異常的花粉管比例為44.8％?；ǚ酃荏w內(nèi)萌發(fā)時(shí)能穿過柱頭組織，但是到達(dá)胚珠的花粉管比例降低，結(jié)籽數(shù)減少。BcPLL9反義RNA轉(zhuǎn)基因植株的成熟花粉粒出現(xiàn)異常的胼胝質(zhì)沉積，萌發(fā)溝部位異常突起，花粉內(nèi)壁缺少清晰的內(nèi)壁內(nèi)層和內(nèi)壁外層結(jié)構(gòu)。
　　 (5)通過基因表達(dá)和功能分析，發(fā)現(xiàn)花粉和雌蕊特異

14、表達(dá)的類果膠酸裂解酶基因BcPLL10與花粉壁發(fā)育相關(guān)。采用同源克隆的方法獲得白菜類果膠酸裂解酶基因BcPLL10的cDNA和DNA全長，核酸結(jié)構(gòu)和氨基酸結(jié)構(gòu)分析表明其同樣具有果膠酸裂解酶基因的特征。qRT-PCR和組織原位雜交分析發(fā)現(xiàn)BcPLL10在成熟花粉粒、雌蕊的柱頭、花柱和胚珠中表達(dá);采用反義RNA技術(shù)抑制BcPLL10基因的表達(dá)后，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株的花粉大小、形態(tài)不一，萌發(fā)溝位置異常，含油層外溢并包裹整顆花粉粒，有時(shí)導(dǎo)致花粉粘連

15、。萌發(fā)溝處內(nèi)壁外層過度增厚，內(nèi)壁內(nèi)層交薄;非萌發(fā)溝處內(nèi)壁的內(nèi)層和外層結(jié)構(gòu)不明顯。
　　 (6)通過PLL基因家族的結(jié)構(gòu)和進(jìn)化模式分析，發(fā)現(xiàn)白菜PLL基因在其3個(gè)亞基因組上有不同的分布密度，表達(dá)模式趨向保守;PLL8、PLL9、 PLL10、PLL11可能是來自基因新功能化或亞功能化。通過對白菜46個(gè)PLL基因在其3個(gè)亞基因組的分布情況分析發(fā)現(xiàn)有18個(gè)位于高密度模塊（lessfractionized, LF）上，分別有16個(gè)和12

16、個(gè)位于兩個(gè)低密度模塊（more fractionized，MF1和MF2）上。這一結(jié)果支持蕓薹屬進(jìn)化過程中經(jīng)歷兩次四倍化跟隨兩次基因丟失過程的假說。對植物PLL基因的結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)PLL8、PLL9、PLL10、PLL11具有不同于其它PLL的N端保守結(jié)構(gòu)域。對白菜PLL基因的表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)BcPLL8、BcPLL9、BcPLL10、BcPLL11在花藥和雌蕊中特異表達(dá)，推測它們是由其祖先基因新功能化或亞功能化產(chǎn)生。
　　 (

17、7)通過基因表達(dá)和功能分析，發(fā)現(xiàn)小孢子和絨氈層特異表達(dá)的BcMF21在花粉發(fā)育早期發(fā)揮作用。采用同源克隆和RACE-PCR技術(shù)對本實(shí)驗(yàn)室前期經(jīng)cDNA-AFLP分析獲得的差異表達(dá)片段（A18T19-4，BBP10/BPO054）克隆獲得基因全長，通過核酸結(jié)構(gòu)和氨基酸結(jié)構(gòu)分析，發(fā)現(xiàn)其與已知基因同源性很低，可能是一個(gè)在花粉發(fā)育早期相關(guān)的新基因，逐按照本實(shí)驗(yàn)室命名與雄性育性相關(guān)的基因系統(tǒng)，命名為Brassica campestris male