煙草腋芽發(fā)育相關(guān)基因的克隆與功能分析.pdf

1、植物分枝發(fā)育在植物形態(tài)建成中具有十分重要的地位。研究表明，植物的分枝發(fā)育過程受遺傳因素和環(huán)境條件等的共同影響。對植物側(cè)枝發(fā)育有顯著調(diào)控作用的基因大部分屬于GRAS、TCP或R2R3-MYB基因家族，這三個基因家族均編碼植物轉(zhuǎn)錄因子。其中，GRAS基因家族成員在植物生長發(fā)育的許多方面發(fā)揮重要的作用;TCP家族是一類與植物器官三維形態(tài)發(fā)育以及細(xì)胞周期調(diào)控相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子;R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子廣泛參與植物的初生和次生代謝、響應(yīng)生物和非生物脅

2、迫等過程。本研究對煙草全基因組內(nèi)GRAS和TCP基因家族進(jìn)行了鑒定和生物信息學(xué)分析，在此基礎(chǔ)上，分別克隆了屬于GRAS基因家族的煙草NtLS基因、屬于TCP基因家族的NtBRC1-Like基因和屬于R2R3-MYB基因家族的NtRAX2基因，它們的直系同源基因都與植物側(cè)枝發(fā)育相關(guān)。對NtLS和NtRAX2基因進(jìn)行過表達(dá)分析、基因沉默研究以及擬南芥互補實驗驗證，探索其對煙草腋芽發(fā)生和發(fā)育的影響，為利用遺傳操作培育無腋芽或少腋芽的煙草新種質(zhì)

3、奠定基礎(chǔ)。本文獲得的主要結(jié)果如下:
　　(1)在煙草基因組中鑒定了95個GRAS家族成員，根據(jù)系統(tǒng)進(jìn)化的分析結(jié)果將它們分為十個亞家族。所有的NtGRAS成員都含有5個高度保守的motif，分別是LHRⅠ、VHIID、LHRⅡ、PFYRE和SAW。該基因家族中約88.42％的基因沒有內(nèi)含子，有定位信息的84個成員分布在煙草的22條染色體上。煙草GRAS基因參與很多生物學(xué)過程的調(diào)控，約74％的NtGRAS蛋白是細(xì)胞核定位。被選取進(jìn)行熒

4、光定量分析的22個NtGRAS基因中人多數(shù)在根和葉片的表達(dá)量最高。
　　(2)在煙草基因組中鑒定了61個TCP家族成員，根據(jù)系統(tǒng)進(jìn)化的分析結(jié)果將它們分為ClassⅠ和ClassⅡ兩個亞家族，其中ClassⅡ又可以分為CIN和CYC/TB1亞簇。所有的NtTCP蛋白都含有高度保守的TCP-domian，有12個成員還另外包含一個R-domian，這12個NtTCP蛋白中有10個屬于CYC/TB1亞簇。該基因家族中約67.2％的基因沒

5、有內(nèi)含子，有定位信息的54個成員分布在煙草的20條染色體上。被選取進(jìn)行熒光定量分析的22個NtTCP基因中絕大多數(shù)在葉片的表達(dá)量最高。
　　(3)從普通煙草中克隆了NtLS基因的2條拷貝，NtLS-S和NtLS-T,前者來自于林煙草，后者來自于絨毛狀煙草。二者序列極為相似，且都沒有內(nèi)含子，分別與GRAS基因家族中的NtLS和NtLSa基因相對應(yīng)。NtLS-S和NtLS-T基因的表達(dá)模式與番茄LeLS、擬南芥AtLAS和菊花DgLS

6、L的表達(dá)模式相似。對NtLS基因構(gòu)建過表達(dá)載體和CRES-T載體并進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，獲得的T0代過表達(dá)轉(zhuǎn)基因煙草比非轉(zhuǎn)基因煙草更早出現(xiàn)腋芽，而且NtLS-S基因能恢復(fù)擬南芥las突變體的表型。
　　(4)從普通煙草中克隆了4個NtBRC1-Like基因，命名為NtBRC1-Like1、2、3和4，分別與TCP基因家族中的NtTCP18a、b、c和d相對應(yīng)。這4個基因?qū)儆谂c植物側(cè)枝發(fā)育相關(guān)的CYC/TB1亞家族，且NtBRC1-Like

7、1/4、 NtBRC1-Like2/3兩兩的遺傳距離較近。4個NtBRC1-Like基因編碼的蛋白除具有核心的TCP-domain外，還具有CYC/TB1簇蛋白特有的R-domain。4個NtBRC1-Like基因在不同的組織中呈現(xiàn)特異性表達(dá)，且其表達(dá)模式可分為兩種:NtBRC1-Like1和4的表達(dá)模式相似，在腋芽中高度表達(dá);NtBRC1-Like2和3的表達(dá)模式十分相像，在葉和腋芽中的表達(dá)量都顯著高于其它組織。NtBRC1-Like

8、2和3被證實是NtBRC1b基因分別來自于林煙草和絨毛狀煙草的2條拷貝，NtBRC1b-S和NtBRC1b-T。為了探索NtBRC1b基因的功能，對其構(gòu)建了過表達(dá)載體，正在研究其功能。
　　(5)從普通煙草中克隆了NtRAX2基因的2條拷貝，來自于林煙草的NtRAX2-S和來自于絨毛狀煙草的NtRAX2-L二者序列高度相似。NtRAX2-S和NtRAX2-T在腋芽和花中高度表達(dá)，在花芽和莖尖中的表達(dá)也維持較高的水平。對NtRAX2