煙草NtLTP4基因的克隆及功能分析.pdf

1、煙草產業(yè)是我國財政稅收收入的重要來源。但是，干旱、鹽堿、病蟲害等逆境脅迫嚴重影響了煙草的產量和品質，從而制約了煙草的產業(yè)發(fā)展。如何提高煙草的生物及非生物脅迫抗性已成為當今研究的重要課題。為了應對這種逆境脅迫，植物本身形成了一套精密而復雜的防御機制。其中各種脅迫相關基因的表達調控在植物應答環(huán)境信號刺激反應過程中起著重要的作用。非特異性脂轉移蛋白(non-specific lipid transfer protein, nsLTPs)在植物

2、抗逆過程中就起到非常重要的作用。本研究以普通煙（Nicotiana tabacum, NC89）為材料，克隆得到NtLTP4基因，并對其進行生物學功能分析，具體研究結果如下：
　　（1）基因序列分析表明，該基因cDNA全長為354bp，編碼117個氨基酸的多肽，預測分子量大約為9kD，其中含有保守的五肽結構域：T/S-X-X-D-R/K和P-Y-X-I-S，且有8個位置保守的半胱氨酸。NtLTP4具有nsLTP蛋白典型的三級結構，

3、即4個α-螺旋，4對二硫鍵，1個可結合和容納脂質分子的疏水腔，對結合脂質分子具有重要的作用。聚類分析表明，煙草NtLTP4與煙樹NgLTP1，擬南芥AtLTP7及AtLTP5等同源性較高，而這些基因均屬于LTP家族中的TypeI類。以上結果表明，NtLTP4屬于LTP家族中的TypeI類。
　?。?）構建35S-NtLTP4::GFP融和表達載體，瞬時侵染本生煙葉片，利用激光共聚焦顯微鏡觀察 GFP熒光，發(fā)現35s-GFP在細胞質

4、和細胞核中均有熒光，但是35s-NtLTP4::GFP只在細胞壁周圍有熒光，說明NtLTP4可能定位在細胞壁，為NtLTP4的功能研究提供了理論依據。
　　（3）采用qRT-PCR的方法，對NtLTP4基因在煙草受到不同脅迫時的表達特性進行了研究。結果表明，NtLTP4存在組織特異性，且轉錄受機械損傷、高鹽和聚乙二醇（PEG）等非生物脅迫誘導；青枯病菌和馬鈴薯Y病毒等生物脅迫也不同程度的誘導該基因的表達；激素信號分子MeJA、AB

5、A和SA可強烈誘導NtLTP4基因的表達。以上結果表明NtLTP4可能參與不同的信號途徑，在植物生長發(fā)育及脅迫應答過程中發(fā)揮重要作用。
　　（4）為研究NtLTP4的功能，構建NtLTP4與正義植物表達載體pROKII的重組載體pROKII-NtLTP4，采用農桿菌介導法轉化普通煙。通過擴增部分表達載體序列鑒定陽性植株。對部分轉基因植株進行qRT-PCR分析，選取NtLTP4表達水平高、中、低的3個株系用于功能分析實驗。
　

6、　（5）鹽脅迫處理后，與野生型普通煙相比，轉基因植株提高了對鹽脅迫的抗性。在含不同濃度NaCl（50mM、100mM和200mM）的MS培養(yǎng)基上，轉基因煙草種子比野生型種子的萌發(fā)率要高；轉基因煙草幼苗比野生型煙草幼苗的根長較長，生長勢好。鹽脅迫條件下，轉基因植株中丙二醛含量較野生型低43％左右，說明轉基因植物細胞膜脂過氧化程度較低，植物細胞受損害程度較輕；鹽脅迫條件下，轉基因植株中 ROS產生相關的基因的表達量降低，ROS清除相關基因的

7、表達量增加，各種抗氧化酶的活性升高， H2O2和O2-含量較野生型分別低29%和18%左右，表明NtLTP4基因通過提高ROS清除相關基因，提高抗氧化酶活性，從而降低了植株中的 ROS含量。以上結果表明，超表達NtLTP4通過提高抗氧化能力進而增加了鹽脅迫抗性。
　　（6）干旱脅迫處理后，超表達NtLTP4的轉基因植株提高了對干旱脅迫的抗性。在含不同濃度的甘露醇MS培養(yǎng)基上，轉基因煙草比野生型幼苗長勢更好；H2O2和O2-含量較野

8、生型分別低25%和21%；且與ROS相關的基因的表達量均有所改變，各種抗氧化酶的活性也有所升高。以上結果表明，超表達NtLTP4可能正調控干旱脅迫抗性。
　?。?）超表達NtLTP4的轉基因植株提高了對青枯病菌（Ralstonia solanacearum）的抗性。與野生型植株相比，青枯菌處理后轉基因植株中與 SA信號途徑相關的 PR基因（PR1a、PR5）和與MeJA相關的PR基因（PR4）的表達量有所增加，推測NtLTP4可能

9、通過SA-和JA-介導的信號途徑的綜合作用提高了對青枯菌的抗性。
　　（8）超表達 NtLTP4的轉基因植株提高了對病毒的抗性。馬鈴薯 Y病毒普通株系（Potato virus Y Ordinary strain, PVY-O）處理后轉基因植株中PR基因（PR1a、PR5）的表達量增加，推測NtLTP4可能通過SA-介導的信號途徑來提高對病毒的抗性。
　　綜上所述，NtLTP4提高了轉基因植株對生物和非生物脅迫的抗性，這些研