擬南芥ANK-TM基因克隆及功能分析.pdf

1、自然條件下，植物生長在開放的環(huán)境中，經(jīng)常會遭遇到環(huán)境條件的劇烈變化，其幅度超過了適于植物正常生命活動的范圍，比如低溫，高溫，干旱，水澇，鹽堿，大氣污染，水質(zhì)污染等，這些不良因素作用于植物，將會引起植物體內(nèi)產(chǎn)生一系列的生理代謝反應(yīng)，因此闡明植物對耐受逆境脅迫的分子機制和改良植物的抗逆性已經(jīng)成為當(dāng)前農(nóng)業(yè)研究的主要目標(biāo)之一。而擬南芥(Arabidopsis thaliana)作為模式植物，已被廣泛應(yīng)用于植物分子生物學(xué)遺傳學(xué)和發(fā)育生物學(xué)的研究。

2、擬南芥的未知功能基因的研究通常是通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)進行。錨蛋白重復(fù)序列(ankyrin repeats)是普遍存在于生物體中的介導(dǎo)蛋白與蛋白相互作用的一種結(jié)構(gòu)域。具有這種結(jié)構(gòu)域的蛋白參與轉(zhuǎn)錄的啟動、細胞周期的調(diào)控、細胞骨架系統(tǒng)的形成及離子的運輸和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。跨膜結(jié)構(gòu)域在生物體中也擔(dān)負著各種各樣的重要功能。本研究應(yīng)用分子生物學(xué)分析并構(gòu)建了擬南芥未知功能基因ANK-TM4.1-4.8的各種植物表達載體，轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌之后浸染花序，獲得了轉(zhuǎn)基因植株，為

3、進一步研究該基因的功能是否具有抗各種逆境脅迫的功能奠定了基礎(chǔ)。主要的研究結(jié)果如下:
　　(1)利用Gateway技術(shù)構(gòu)建各種表達載體及轉(zhuǎn)化擬南芥:以pGWB406，pGWB502Ω，pGWB533這三種表達載體為基礎(chǔ)，分別構(gòu)建了擬南芥ANK-TM4.1-4.8這八個基因的GFP融合表達載體，超表達載體，以及GUS融合表達載體。然后用花絮浸染法轉(zhuǎn)化擬南芥，在含有Basra抗性的1/2MS的培養(yǎng)基上篩選T1代轉(zhuǎn)基因植株。目前正在篩選T

4、2代轉(zhuǎn)基因植株。
　　(2)利用T-DNA插入突變體研究這些基因的功能:從ABRC購買到相應(yīng)ANK-TM4.1-4.8這八個基因的T-DNA插入突變體，通過PCR鑒定獲得相應(yīng)突變體的純合體，目前八個基因中，已經(jīng)有5個獲得了純合突變體，種子在進一步擴繁中，準(zhǔn)備用于下一步的生理表型鑒定。
　　(3) RT-PCR檢測ANK-TM4.1-4.8的T-DNA插入純合突變體中目標(biāo)基因表達量的變化。4.1，4.2，4.5，4.8這4個基