葡萄ERF基因的克隆及功能分析.pdf

1、鹽堿、低溫和干旱等逆境脅迫是限制植物生長(zhǎng)發(fā)育的重要因子，也是影響作物產(chǎn)量的主要脅迫因素。在逆境脅迫條件下，植物首先要通過多種途徑感應(yīng)環(huán)境的變化，然后將環(huán)境變化轉(zhuǎn)變?yōu)榧?xì)胞內(nèi)部的信號(hào)，在接受了細(xì)胞的內(nèi)部信號(hào)后，轉(zhuǎn)錄因子等反式作用因子與順式作用元件結(jié)合來啟動(dòng)抗逆基因的表達(dá)，從而提高植物的。許多植物逆境脅迫誘導(dǎo)基因的表達(dá)都在轉(zhuǎn)錄水平上受到轉(zhuǎn)錄因子和順式作用成分的調(diào)控，因此轉(zhuǎn)錄因子在植物抗逆信號(hào)傳遞過程中起著中心調(diào)節(jié)的作用。
　　 本文主

2、要分兩部分對(duì)葡萄的轉(zhuǎn)錄因子ERF進(jìn)行研究：
　　 1.利用生物信息學(xué)的方法，對(duì)TIGR葡萄基因數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行搜索，從中獲得了9個(gè)包含AP2/ERF結(jié)構(gòu)域的全長(zhǎng)ORF序列。應(yīng)用生物信息學(xué)的方法對(duì)這9個(gè)基因進(jìn)行了如下的分析：
　　 1)運(yùn)用生物信息學(xué)的方法和工具對(duì)其核酸和氨基酸序列進(jìn)行進(jìn)一步的分析，在對(duì)它們的組成成分、信號(hào)肽、磷酸化位點(diǎn)、三級(jí)結(jié)構(gòu)、基因組中定位的信息及功能結(jié)構(gòu)域的預(yù)測(cè)等表明：這9個(gè)基因均含有完整的AP2/ERF結(jié)

3、構(gòu)域，除了ERF2-1、ERF2-2、ERF3c外，都具有信號(hào)肽序列，并且每個(gè)基因都有多個(gè)絲氨酸磷酸化位點(diǎn)；
　　 2)將這9個(gè)基因與確定的擬南芥ERF基因序列進(jìn)行比對(duì)及系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明，ERF家族成員AP2/ERF結(jié)構(gòu)域在葡萄和擬南芥中是非常保守的，并且每個(gè)預(yù)測(cè)的葡萄中ERF基因均與擬南芥的ERF因有不同程度的相似性，這為我們研究葡萄ERF基因的功能提供了方向。
　　 此外，我們獲得了VvERF2-2、VvERF3a

4、、VvERF3b、VvERF3c、VvERF4-15個(gè)基因的克隆，為下一步研究打下基礎(chǔ)。
　　 2.為了更深入的研究葡萄中ERE基因的功能，我們以VvERF3a、VvERF3b兩個(gè)基因?yàn)檠芯繉?duì)象進(jìn)行了下列研究：
　　 1)采用半定量的方法，分別研究了VvERF3a、VvERF3b這兩個(gè)基因在高鹽脅迫條件下的誘導(dǎo)表達(dá)模式，以及它們對(duì)植物激素SA、ABA、ET的響應(yīng)情況。結(jié)果表明：VvERF3a和VvERF3b基因均受ET、

5、ABA和SA的誘導(dǎo)，但不響應(yīng)鹽脅迫。這也暗示了，它們可能參與了SA、ABA、ET的信號(hào)響應(yīng)途徑。
　　 2)通過酵母激活實(shí)驗(yàn)確定了VvERF3a、VvERF3b基因的轉(zhuǎn)錄激活活性。實(shí)驗(yàn)表明：VvERF3a、VvERF3b堪因與GAL4-BD融合，在酵母表達(dá)系統(tǒng)內(nèi)能激活報(bào)告基因的表達(dá)，轉(zhuǎn)化酵母后能在SD/-Trp-His-Ade培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，說明這兩個(gè)基因具有轉(zhuǎn)錄激活活性。
　　 3)為了進(jìn)一步研究VvERF3a、VvER