甘薯GGDS基因克隆及功能分析.pdf

1、甘薯在發(fā)展中國家最重要的糧食作物中排名第五，僅次于水稻，小麥，玉米和木薯。很多研究表明甘薯是最健康的食物，因為其富含多種復雜的碳水化合物，抗氧化的花色素苷和多種類胡蘿卜素等。甘薯薯塊的顏色有白色，黃色，紫色和橘色等，但是只有橘色品種的甘薯才含有豐富的維他命A的前體物質β-胡蘿卜素。事實上，橘色品種的甘薯在非洲和東南亞的不發(fā)達國家是人們獲得β-胡蘿卜素的主要來源。然而，甘薯中的β-胡蘿卜素含量遠遠低于人類生理活動的正常需求，這將會導致一系

2、列的維他命A缺乏癥，比如干眼癥，角膜病變，角膜軟化，有的甚至導致死亡。所以提高甘薯中β-胡蘿卜素的含量有著重要意義。
　　基于甘薯中類胡蘿卜素生物合成途徑的分子和生物化學水平通過基因工程手段改造β-胡蘿卜素代謝途徑來提高甘薯中β-胡蘿卜素含量是可行的方法之一。類胡蘿卜素合成機制在果實和花中已經被普遍研究，但是很少在地下根組織中研究。20碳的牻牛兒基牻牛兒基二磷酸是一種一系列物質的普遍前體，這些物質包括:β-胡蘿卜素，葉綠素，植物激

3、素（ABA和GA），葉綠醌，生育酚等。牻牛兒基牻牛兒基二磷酸合成酶(GGDS)催化異戊二烯二磷酸和二甲基丙烯基二磷酸合成牻牛兒基牻牛兒基二磷酸(GGDP)。
　　本研究從甘薯中克隆得到了類胡蘿卜素合成途徑中的一個異戊烯基轉移酶基因(IbGGDS，GenBank登錄號:KF991091)，并對其進行生物信息學分析，結果表明，該基因cDNA全長1409bp，其中包含了一個1092bp的開放閱讀框，編碼一個含363個氨基酸殘基的多肽。通

4、過氨基酸序列多重比對發(fā)現該基因的氨基酸序列和預測的蛋白結構和已經報道的牻牛兒基牻牛兒基二磷酸合成酶(GGDS)和牻牛兒基二磷酸合成酶(GPPS)的一個大亞基高度相似。IbGGDS的N端有一個63個氨基酸的質體轉運肽。將核心編碼區(qū)的1092bp核苷酸序列以及編碼質體轉運肽的189bp核苷酸序列構建亞細胞定位載體，轉化煙草的原生質體。在激光共聚焦顯微鏡下觀察到IbGGDS蛋白及其質體轉運肽確實使GFP轉運到葉綠體。IbGGDS的質體定位證明

5、了該基因編碼蛋白質定位于合成β-胡蘿卜素的場所-質體。用切去質體轉運肽的IbGGDS在大腸桿菌中重建β-胡蘿卜素代謝途徑，含有IbGGDS的工程菌因為生產類胡蘿卜素而變成黃色。這就證明了乃GGDS編碼的酶具有合成牻牛兒基牻牛兒基二磷酸的功能。
　　最后，本研究采用qPCR的方法對IbGGDS和其下游五個β-胡蘿卜素合成途徑基因包括PSY、 PDS、ZDS、crtlSO和LYCB在橘黃色薯塊的甘薯塊根、須根、成熟葉片、幼嫩葉片、成熟

6、莖、幼嫩莖、成熟葉柄這七個組織的相對表達量分析，就IbGGDS來說，在塊根中的相對表達量分別比須根、成熟莖、成熟葉柄、成熟葉、幼嫩葉和幼嫩莖高18、25、18、4、5和14倍。PSY是β-胡蘿卜素途徑上的第一個關鍵酶，LYCB是β-胡蘿卜素途徑上的最后一個關鍵酶。PSY在塊根中的相對表達量分別比須根、成熟莖、成熟葉柄、成熟葉片、幼嫩葉片和幼嫩莖高618、898、93、88、22和648倍，LYCB在塊根中的相對表達量分別比須根、成熟莖、

7、成熟葉柄、成熟葉片、幼嫩葉片和幼嫩莖高167、45、42、15、8和49倍。結果表明lbGGDS、PSY、 PDS、ZDS、crtlSO和LYCB都是在塊根中特異表達，基因表達分析結果表明甘薯地下塊根是β-胡蘿卜素生物合成的主要器官。
　　通過HPLC的方法對相應組織的β-胡蘿卜素含量進行分析發(fā)現，成熟葉片中的β-胡蘿卜素含量為1.72±0.059 mg/g FW，幼嫩葉片中β-胡蘿卜素含量為1.13±0.034 mg/g FW，

8、分別比塊根中的含量(0.19±0.020 mg/g FW)高了9.11倍和5.98倍。須根中檢測到少量的β-胡蘿卜素（0.06±0.002 mg/g FW），成熟葉柄和成熟莖中只能檢測到微量的β-胡蘿卜素(分別為0.015±0.002 mg/g FW和0.008±0.001mg/g FW)。有意思的是，成熟葉片和幼嫩葉片中β-胡蘿卜素含量遠遠高于塊根，甘薯葉片是β-胡蘿卜素的主要儲存器官。本研究推測β-胡蘿卜素在甘薯的塊根中合成后通過某