橡膠草HMGR基因的克隆及功能分析.pdf

1、目的：天然橡膠是一種特殊品質(zhì)的生物聚合物，而不能被人工合成的橡膠所取代，天然橡膠的生物合成是通過產(chǎn)膠植物的類異戊二烯代謝途徑進(jìn)行的，例如橡膠樹、杜仲、銀膠菊、橡膠草（又稱俄羅斯蒲公英）等等。其中橡膠草一直以來被認(rèn)為是低成本的潛在橡膠替代來源，他們生長周期短、遺傳轉(zhuǎn)化體系完善。在他們的根部可以合成高質(zhì)量的天然橡膠，而改良后的橡膠草就是一種更具有經(jīng)濟(jì)價(jià)值可持續(xù)利用的產(chǎn)膠草本植物，因此在橡膠生產(chǎn)行業(yè)是一種有發(fā)展前景和可以商業(yè)化的資源。本研究主

2、要是通過在橡膠草中過量表達(dá) HMGR基因來控制橡膠草甲羥戊酸代謝途徑中的異戊烯焦磷酸的合成，進(jìn)而研究該基因在產(chǎn)膠代謝中的作用。因此橡膠草是研究植物產(chǎn)膠機(jī)理的良好模式植物，其乳管也可以作為產(chǎn)膠功能基因鑒定平臺，是具有發(fā)展前途的產(chǎn)膠植物。
　　方法：本研究在優(yōu)化的橡膠草再生體系的基礎(chǔ)上，分別以橡膠草cDNA和橡膠樹的DNA為模板，克隆橡膠草HMGR基因和橡膠樹HMGR1基因的特異性啟動(dòng)子HbHMGR基因，對HMGR基因進(jìn)行了生物信息學(xué)

3、分析。構(gòu)建原核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化BL21菌株并誘導(dǎo)表達(dá)；構(gòu)建細(xì)胞融合表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化GV3101菌株并侵染洋蔥表皮細(xì)胞，在共聚焦顯微鏡下觀察基因表達(dá)情況；構(gòu)建植物過表達(dá)載體，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)入橡膠草，獲得轉(zhuǎn)基因植株，轉(zhuǎn)基因植株分子檢測的結(jié)果表明外源基因已經(jīng)整合到橡膠草基因組中，并對轉(zhuǎn)基因橡膠草進(jìn)行了基因表達(dá)量分析。
　　結(jié)果
　?。?）克隆獲得橡膠草 HMGR基因和橡膠樹 HMGR1基因的特異性啟動(dòng)子HbHMGR1基因， HMG

4、R基因含有一個(gè)1749bp大小的開放閱讀框，編碼582個(gè)氨基酸，HMG-CoA還原酶屬于HMG-CoA還原酶超家族中的一員；
　?。?）構(gòu)建原核表達(dá)載體，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)和SDS-PAGE檢測，HMGR蛋白在BL21菌株中成功表達(dá)，分子量為62.6591KDa，當(dāng)誘導(dǎo)6h時(shí)表達(dá)量最高；
　?。?）構(gòu)建細(xì)胞融合表達(dá)載體，亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示，HMGR-GFP融合蛋白主要定位于細(xì)胞膜和核膜上；
　　（4）對橡膠草的再生體系優(yōu)化

5、的結(jié)果表明，以橡膠草的葉柄作為外植體，誘導(dǎo)不定芽的激素配比為1mg/L6-BA+0.1mg/L NAA，不定芽生根的激素配比為0.1mg/L NAA；
　?。?）構(gòu)建植物過表達(dá)載體 pCAMBIA2300-35S-TkHMGR和pCAMBIA-1303-HbHMGR1-TkHMGR，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法侵染橡膠草莖，經(jīng)PCR鑒定獲得轉(zhuǎn)基因橡膠草，對獲得的轉(zhuǎn)基因橡膠草進(jìn)行Real Time-PCR分析，表明外源基因隨機(jī)整合到橡膠草的基因