甘薯ISSR分子標(biāo)記的建立與IPI基因的克隆及功能分析.pdf

1、甘薯(Ipomoeabatatas(L.)Lam.)是我國(guó)四大主要糧食作物之一，總產(chǎn)量和種植面積均居世界首位。甘薯是一種以無(wú)性繁殖為主的植物，在種質(zhì)資源搜集、保存過(guò)程中，存在一個(gè)品種由于名稱不同，導(dǎo)致多個(gè)副本被收集、保存的情況。同時(shí)，我國(guó)育成的甘薯品種遺傳基礎(chǔ)狹窄，選育突破性的新品種相當(dāng)困難，明確甘薯品種的遺傳多樣性是其品種改良的基礎(chǔ)。由于其遺傳背景復(fù)雜，采用傳統(tǒng)方法對(duì)其品種難以準(zhǔn)確鑒別，而DNA分子標(biāo)記可以鑒定形態(tài)學(xué)上難以分辨的物種。

2、通過(guò)建立甘薯的DNA指紋圖譜，獲得具有鑒別性的特征，在分子水平上鑒別種質(zhì)資源，能作為傳統(tǒng)鑒定方法的補(bǔ)充和發(fā)展，同時(shí)為尋找、保護(hù)和利用優(yōu)良的種質(zhì)資源提供分子水平的依據(jù)。本實(shí)驗(yàn)對(duì)13個(gè)品種的甘薯進(jìn)行了ISSR分子標(biāo)記及分析。 甘薯中含有以β-胡蘿卜素為代表的多種類胡蘿卜素，它們?cè)隗w內(nèi)能轉(zhuǎn)換成維生素A或者視黃醇，其在淬滅自由基、增強(qiáng)人體免疫力、預(yù)防心血管疾病和防癌、抗癌方面的作用越來(lái)越引起人們的重視。類胡蘿卜素前體的生物合成來(lái)源于經(jīng)典

3、的MVA途徑和新近發(fā)現(xiàn)的MEP途徑。為研究類胡蘿卜素前體生物合成途徑的分子生物學(xué)，本研究采用RACE方法從渝薯303中克隆了類胡蘿卜素生物合成途徑上一個(gè)重要基因的全長(zhǎng)cDNA-IbIPI(isopentenyldiphosphateisomerasegenefromIpomoeabatatas(L.)Lam.，甘薯異戊烯焦磷酸異構(gòu)酶基因)，并對(duì)該基因及其編碼的酶進(jìn)行了生物信息學(xué)分析；在大腸桿菌中過(guò)量表達(dá)IbIPI推動(dòng)了MEP途徑代謝流向

4、下游流動(dòng)，促進(jìn)類胡蘿卜素的生物合成而驗(yàn)證了IbIPI的功能。對(duì)IbIPI基因的研究為深入闡明類胡蘿卜素生物合成的分子生物學(xué)和生物化學(xué)機(jī)理奠定了基礎(chǔ)，為利用甘薯進(jìn)行類胡蘿卜素的代謝工程提供了可能的調(diào)控靶點(diǎn)。 1甘薯ISSR分子標(biāo)記方法的建立 采用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)，對(duì)九州55、綿粉1號(hào)、澳墨紅、壅菜種、廣茨16、亞4、B50-285、恒進(jìn)、渝紫263、臺(tái)農(nóng)10號(hào)、南薯88、臺(tái)農(nóng)69、川山紫等13個(gè)甘薯品種塊根DNA進(jìn)行了

5、研究。從20條引物中篩選到2條有效引物用于正式擴(kuò)增，共擴(kuò)增出11個(gè)基因位點(diǎn)，其中多態(tài)性條帶有7條，多態(tài)性比率為63.6％，從而建立了甘薯塊根DNA的ISSR方法。 2IbIPI全長(zhǎng)cDNA的克隆 本研究從渝薯303葉片中提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄成第一鏈cDNA。采用基于序列同源性的方法，根據(jù)已知異戊烯焦磷酸異構(gòu)酶基因的保守序列設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物，以合成的cDNA為模板，采用溫度梯度PCR，擴(kuò)增IPI基因的核心片段，獲得600bp左

6、右的產(chǎn)物，經(jīng)亞克隆和測(cè)序知，該片段為597bp。根據(jù)獲得的IbIPI核心序列，分別設(shè)計(jì)用于3’RACE和5'RACE的特異性引物，擴(kuò)增IPI基因的3’和5’末端片段，得到461bp和423bp的cDNA片段。將前后獲得的核心片段、3’和5’末端序列拼接起來(lái)，得到推導(dǎo)的IbIPI全長(zhǎng)cDNA序列，采用RT-PCR進(jìn)行驗(yàn)證并獲得物理全長(zhǎng)，IbIPI的全長(zhǎng)cDNA序列為1155bp，包括5’、3’UTR和polyA尾部序列。 3IbI

7、PI的生物信息學(xué)分析 對(duì)IbIPI的基本性質(zhì)研究發(fā)現(xiàn)，IbIPI編碼的是一個(gè)含296個(gè)氨基酸殘基的多肽，該多肽的分子量為33.8kDa，等電點(diǎn)為5.7。IbIPI氨基酸序列比對(duì)結(jié)果顯示甘薯IPI屬于IPI家族，并且與以前報(bào)道的其它植物物種中的IPI有很高的相似性。 將來(lái)自不同植物的IPI進(jìn)行多重比對(duì)，發(fā)現(xiàn)植物IPI的氨基酸序列相似性很高。根據(jù)植物IPI比對(duì)結(jié)果，可以看到植物IPI的N-端是一個(gè)氨基酸序列沒(méi)有同源性的區(qū)域。

8、TargetP分析表明IbIPI具有一個(gè)長(zhǎng)為57個(gè)氨基酸的質(zhì)體轉(zhuǎn)運(yùn)肽，在這個(gè)區(qū)域后是高度同源的區(qū)域，也就是IPI的功能區(qū)段。 用來(lái)自細(xì)菌、真菌、動(dòng)物、藻類和植物的IPI全長(zhǎng)氨基酸序列構(gòu)建了IPI的分子系統(tǒng)樹(shù)，表明IPI可以分為來(lái)自原核生物和真核生物的類群；而在真核生物中，IPI的分子系統(tǒng)進(jìn)化表現(xiàn)出與物種系統(tǒng)進(jìn)化的相關(guān)性，可以分為真菌、藻類、動(dòng)物和植物類群。 4IbIPI的功能驗(yàn)證 用甘薯IPI的編碼區(qū)替換pTrc