稻瘟病菌含LXAR序列元件效應(yīng)分子的克隆和功能分析及稻瘟菌無毒基因的分子標(biāo)記.pdf

1、稻瘟病是一種由稻瘟病菌引起的的毀滅性病害,給全世界的水稻生產(chǎn)和安全帶來了巨大威脅。稻瘟病菌在侵染水稻時,通過特殊機制將稻瘟病菌效應(yīng)分子轉(zhuǎn)運至水稻細(xì)胞內(nèi),從而干擾和抑制水稻的免疫抗性反應(yīng),實現(xiàn)對水稻的成功侵染。通過生物信息學(xué)分析和煙草接種實驗發(fā)現(xiàn)了17個含有LXAR序列元件的效應(yīng)分子基因能夠非常顯著地抑制BAX誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡,對這些基因進(jìn)行鑒定和功能研究對于明確稻瘟病菌與水稻互作的分子機制有重大意義。本研究主要分為以下四個方面:
　

2、　 1過表達(dá)載體的構(gòu)建和稻瘟病菌轉(zhuǎn)化通過酶切連接反應(yīng)將目的基因克隆到過表達(dá)載體的上,然后轉(zhuǎn)化到稻瘟病菌Guyl1原生質(zhì)體中得到過表達(dá)突變體。構(gòu)建了17個含有LXAR序列元件的效應(yīng)分子基因過表達(dá)載體,并轉(zhuǎn)入稻瘟病菌Guyl1中。
　　 2稻瘟病菌含有LXAR序列元件的效應(yīng)分子基因編碼區(qū)序列和啟動子區(qū)序列的多態(tài)性分析搜集60個國內(nèi)和國際不同地區(qū)的稻瘟病菌代表菌株,分析菌株的生物學(xué)性狀,最后確定了11個不同地理分布,不同致病性的菌株

3、。同時,從17個含有LCAR序列元件的效應(yīng)分子基因當(dāng)中選取10個擴(kuò)增效率高、代表性強的基因作為研究對象進(jìn)行序列多態(tài)性分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)編碼區(qū)序列未發(fā)現(xiàn)明顯的多態(tài)性,但啟動子區(qū)轉(zhuǎn)座因子則表現(xiàn)顯著地多態(tài)性,說明效應(yīng)分子面臨正向選擇壓力。
　　 3部分含有LXAR序列元件的效應(yīng)分子基因敲除及突變體菌株性狀分析完成了5個標(biāo)基因(P1_3119,P2_2484,P1_2310,P2_6480,P2_3959)敲除載體的構(gòu)建,其中2個基因(P1

4、_3119,P2_2484)已經(jīng)得到敲除突變體。與野生菌株Guyl1比較,過表達(dá)P2_2484的突變體生長速度略有加快,并且孢子存在一定的畸形現(xiàn)象,而P2_2484敲除突變體則差異不明顯,表明P2_2484很可能是與生長相關(guān)的微效基因。P1_3119敲除突變體和過表達(dá)突變體在菌落形態(tài)、生長速度、孢子萌發(fā)以及致病性上無明顯差異。
　　 4稻瘟病菌AvrPiSH-S基因的分子標(biāo)記利用傳統(tǒng)的圖位克隆方法對稻瘟病菌株P(guān)131和S1528

5、雜交后代進(jìn)行無毒基因分子標(biāo)記。首先,篩選得至B水稻近等基因系IRBLSH-S品種對P131和S1528存在致病性差異,推測S1528含有AvrPiSH-S無毒基因。其次,以鑒別得到水稻近等基因系IRBLSH-S為測試品種,完成了97個后代子囊孢子進(jìn)行致病性測定,分離比率大致為1:1,說明S1528是單個無毒基因控制的。然后從75對PATE標(biāo)記引物對中篩選得到了P7引物對S1528、抗池、兩個隨機抗性菌株和P131、感池、兩個隨機毒性菌株