稻瘟病菌Mgvam7基因的克隆與功能分析.pdf

1、稻瘟病是世界上最嚴(yán)重的糧食作物病害之一，由于稻瘟病菌研究的重要經(jīng)濟(jì)和社會意義及稻瘟病菌容易培養(yǎng)、遺傳轉(zhuǎn)化體系成熟等特點，稻瘟病菌已經(jīng)成為植物病原真菌研究的模式系統(tǒng)，膜泡運輸對于蛋白質(zhì)的運輸和分泌至關(guān)重要，其中SNARE蛋白是膜泡運輸過程中十分保守的一類蛋白。稻瘟病菌在侵染植物過程中分泌大量的外泌蛋白，而迄今關(guān)于膜泡運輸系統(tǒng)在植物病原真菌的致病性及其生長發(fā)育、細(xì)胞分化等方面的作用鮮有報道。為了分析膜泡運輸相關(guān)組分在稻瘟病菌中的功能，本研究

2、對稻瘟病菌膜泡運輸SNARE蛋白基因Mgvam7的功能進(jìn)行了研究。 首先根據(jù)同源序列比對，在稻瘟病菌基因組數(shù)據(jù)庫搜索到一個與酵母vam7基因同源的基因，命名為Mgvam7，序列分析表明該基因編碼的蛋白含有375個氨基酸，其氨基酸序列與酵母的SNARE蛋白vamp7的同源性僅為24％,該蛋白包含一個PX結(jié)構(gòu)域和一個SNARE結(jié)構(gòu)域；該基因可以互補(bǔ)酵母vam7基因突變體在含有CalcoflourWhite(CFW)的培養(yǎng)基平板上的生

3、長缺陷，同時FM4-64染色顯示該基因能夠互補(bǔ)酵母突變體液泡形態(tài)上的缺陷，表明該基因編碼一個具有SNARE蛋白功能的VAM7蛋白。進(jìn)一步將報告基因eGFP構(gòu)建在Mgvam7基因的啟動子下游來分析該基因表達(dá)的組織特異性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該基因在菌絲、分生孢子、芽管、附著胞階段均有表達(dá)。 采用原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化和同源重組技術(shù)獲得了稻瘟病菌的Mgvam7敲除突變體，對其多種生物學(xué)表型進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示突變體對金屬離子、營養(yǎng)、滲透壓等液泡功能相關(guān)的

4、脅迫耐受性減弱，已證明在稻瘟病菌中，脂肪粒主要主要存在于液泡中，可以通過采用Nile red染色法觀察脂肪粒來分析液泡形態(tài)的變化。該染色法發(fā)現(xiàn)，與野生型菌株相比，突變體脂肪粒增多，且多呈碎球狀，表明突變體的液泡發(fā)生片段化。細(xì)胞壁和細(xì)胞膜脅迫因子處理發(fā)現(xiàn)突變體而對SDS更加敏感而對CFW的耐受增加，同時對菌絲進(jìn)行CFW染色顯示突變體細(xì)胞壁幾丁質(zhì)分布發(fā)生變化。頂體結(jié)構(gòu)是真菌菌絲頂端重要的細(xì)胞器，通常與真菌極性生長、細(xì)胞壁合成相關(guān)。FM4-6

5、4染色觀察到突變體菌絲頂端不能形成正常的頂體結(jié)構(gòu)，同時采用FM4-64跟蹤試驗觀察到突變體不能進(jìn)行正常的胞吞作用，而BFA處理可以部分恢復(fù)突變體的胞吞作用，表明BFA作用于Mgvam7的下游調(diào)控胞吞作用。已證明活性氧對真菌發(fā)育和極性生長有重要調(diào)節(jié)作用，利用熒光染料對菌絲頂端活性氧染色發(fā)現(xiàn)突變體內(nèi)活性氧積累顯著減少。進(jìn)一步產(chǎn)孢分析發(fā)現(xiàn)突變體存在嚴(yán)重的產(chǎn)孢缺陷，采用菌絲片段離體接種發(fā)現(xiàn)突變體均不能侵染大麥和水稻。 綜上研究表明Mgv