稻瘟病菌致病相關基因的克隆與功能分析.pdf

1、稻瘟病菌是水稻稻瘟病害的病原菌，而稻瘟病是全球水稻生產的一個重大危害。據報道，世界上85個國家均有稻瘟病害發(fā)生，在病害流行季節(jié)可導致水稻70-80％的產量損失。稻瘟病菌，屬于子囊真菌，也是一種重要的研究病原菌分子致病機制的模式生物，具有重要的科研和經濟價值。水稻是世界上最重要的糧食作物，提供人類約23％的能量。另外，稻瘟病菌和水稻易于遺傳操作，而且基因組序列已經公布。
　　 稻瘟病菌是通過一個特殊的侵染結構——附著胞，通過產生侵

2、染釘并借助于強大的細胞內膨壓穿透寄主表皮，進而侵染水稻組織。研究表明，附著胞的侵染受多種信號轉導途徑的調控，如G蛋白、環(huán)化腺苷酸(cAMP)、促分裂素原活化蛋白激酶(MAPK)和Ca2+離子等信號途徑。這些信號基因的缺失導致致病性的喪失或減弱，并影響細胞發(fā)育的多個方面如交配、產孢和生長速率，這些信號組件可能是抗真菌藥物的靶標。盡管致病相關基因已經被克隆分析，但為了更全面的了解該菌的致病機理，仍需進一步開展大量的研究工作。
　　

3、開展稻瘟病菌致病基因的研究，不僅有助于更好地理解該菌的致病過程，同時可為稻瘟病的防治提供藥物靶標。本文對稻瘟病基因包括:FIS1(MGG_06075)、YPL1(MGG_14620)、NUC1(MGG_05324)、AIF1(MGG_08262)、 ZAP1(MGG_04456)、STM1(MGG_05307)、CAPN1(MGG_14872)、CAPN3(MGG_08067)和CAPN4(MGG_04818)進行了研究。為了探究這些基

4、因的功能，首先對基因進行生物信息學分析，然后將目的基因連接入含有抗性篩選基因（HPH/SUR/BAR/NEO）的pBS載體骨架中，構建基因敲除載體。載體經過PCR和酶切驗證后，導入農桿菌AGL1中，通過ATMT轉化稻瘟病菌Guy-11分生孢子。轉化子經過抗生素篩選平板篩選、PCR驗證以及Southern雜交驗證，獲得基因敲除突變體，并進行單孢分離、保存，用于后續(xù)研究。
　　 為了研究基因的具體功能，對基因敲除突變體進行表型測定與

5、分析，包括:菌絲生長速度、孢子形成、孢子萌發(fā)、附著胞形成、附著胞膨壓、細胞核固縮、細胞凋亡、細胞壁完整性、菌絲疏水性、滲透脅迫、氧脅迫、有性交配和水稻致病性等測定。
　　 在所有測定的突變體中，僅有MoFIS1基因敲除突變體（AMoFIS）較野生型Guy-11有明顯的表型差異。為了證明是否是該基因的缺失造成的表型差異，進行了該突變體的基因互補實驗。通過表型觀察和PCR擴增篩選產生的互補轉化子。通過ATMT將GFP標記的MoFIS

6、1全長編碼序列轉化進入△MoFIS1來觀察該基因在菌絲和孢子中的定位。在激光掃描共聚焦顯微鏡40倍下觀察菌絲和孢子中GFP的定位與表達。
　　 △MoFIS1與野生菌株Guy-11相比產孢量明顯下降，表明該基因與產孢相關。同時，在接種9天后的CM平板上該突變體生長減慢。在稻瘟病感病水稻和大麥葉片上，突變體較Guy-11的病斑數(shù)和嚴重程度明顯減少，病斑小且數(shù)量少。而Guy-11和△MoFIS1回補菌株均產生典型病斑，表明該基因與稻

7、瘟病致病性相關?！鱉oFIS1的分生孢子的萌發(fā)(2h和4h)以及附著胞的形成(6h)與Guy-11及回補菌株均無明顯差異。△MoFIS1對NaCl、H2O2和一些化學物質形成的逆境脅迫耐受力下降。在MM、MM-C、和MM-N培養(yǎng)基上接種8天后，△MoIS1菌落生長減緩。在細胞壁完整性試驗中，△MoFIS1生長減慢，但是光暈圈降解與Guy-11相似?！鱉oFIS1菌絲較Guy-11疏水性無明顯差異。進行有性交配實驗，發(fā)現(xiàn)突變體和其交配型菌

8、株2539在菌落交界處形成許多子囊，表明該基因的缺失不影響菌株的有性生殖。在激光共聚焦顯微鏡下觀察該基因在孢子和菌絲中的定位，表明該基因定位在孢子和菌絲細胞線粒體中。
　　 然而，基因MoYPL1、MoNUC1、MoAIF1、MoZAP1、MoSTM1、MoCAPN1、MoCAPN3和MoCAPN4的敲除突變體在致病性、菌落生長、產孢、孢子萌發(fā)、附著胞形成以及有性生殖等方面較Guy-11無明顯差異，表明這些基因的缺失對稻瘟病菌致