轉(zhuǎn)錄因子Moap1及其相關(guān)基因在稻瘟病菌生長發(fā)育和致病中的功能分析.pdf

1、稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)是水稻生產(chǎn)上最具破壞性的病原菌之一,由其引起的稻瘟病嚴(yán)重威脅著全球水稻的生產(chǎn)安全。目前,對該病害的控制主要以選育和利用抗病品種為主,同時以化學(xué)農(nóng)藥防治為輔,但由于該病原菌易變,新的致病和抗藥性群體的產(chǎn)生分別易導(dǎo)致新選育的抗病品種和藥劑失去利用價值。因此,稻瘟病的防治始終是水稻生產(chǎn)上的一個重要難題,而控制該病害的重要前提是了解該病原菌的生長發(fā)育及致病分子調(diào)控機制。近年來,水稻和稻瘟菌全基因組

2、測序工作的完成加速了稻瘟菌致病相關(guān)基因的發(fā)掘,同時也為從基因組水平上理解稻瘟病菌致病的分子機理提供了一個新的平臺。本論文主要對轉(zhuǎn)錄因子Moapl及其相關(guān)基因在稻瘟菌生長發(fā)育及致病中的相關(guān)功能進(jìn)行了系統(tǒng)的研究,結(jié)果如下:
　　 本文從稻瘟病菌全基因組數(shù)據(jù)庫中鑒定了一個與粟酒裂殖酵母轉(zhuǎn)錄因子PAP1高度同源的bZIP轉(zhuǎn)錄因子Moapl,該轉(zhuǎn)錄因子具有YAP1轉(zhuǎn)錄因子的典型結(jié)構(gòu)域,并可互補釀酒酵母yapl缺失突變體對過氧化氫的敏感性。

3、Moapl的敲除對稻瘟病菌生長速率沒有明顯影響,但是導(dǎo)致其對過氧化氫耐受性降低、胞外漆酶和過氧化物酶活性顯著下降；同時該基因的敲除使稻瘟菌分生孢子形成能力顯著降低,且突變體產(chǎn)生的分生孢子形態(tài)發(fā)生改變；突變體分生孢子及其附著胞中活性氧(Reactive oxygenspecies,ROS)積累增加；該突變體的附著胞可穿透洋蔥表皮細(xì)胞,但是不能正常擴展；該突變體喪失了對水稻敏感品種CO-39的致病性。進(jìn)一步對突變體進(jìn)行RNA—SEQ分析,發(fā)

4、現(xiàn)有1200個基因的表達(dá)量不同程度地發(fā)生改變,51個參與氧化還原反應(yīng)的基因在突變體體中下調(diào)表達(dá),3個漆酶及14個胞外過氧化物酶基因的轉(zhuǎn)錄較野生型菌株顯著下降；稻瘟菌中參與產(chǎn)孢梗形成的基因COS1在突變體中顯著下調(diào)表達(dá),同時,在突變體中,致病性相關(guān)基因MPG1較野生型菌株亦顯著下調(diào)表達(dá)。
　　 從稻瘟病菌Moapl突變體轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中獲得了一個顯著下調(diào)表達(dá)(4.7倍)的SSADH酶編碼基因-Mossadh,該基因全長1611 bp,

5、含有兩個內(nèi)含子,其編碼的蛋白含536個氨基酸。該基因敲除導(dǎo)致生長速率顯著下降、對外源的H2O2脅迫敏感,突變體胞外漆酶和過氧化物酶活性顯著降低；突變體在CM和產(chǎn)孢培養(yǎng)基上生長均不能產(chǎn)氣生菌絲；Mossadh缺失突變體不產(chǎn)分生孢子；該突變體喪失對水稻和大麥的侵染能力,進(jìn)一步試驗觀察到突變體菌絲在洋蔥表皮細(xì)胞上形成附著胞的能力較野生型菌株顯著降低,且其附著胞喪失了穿透洋蔥表皮細(xì)胞壁的能力。
　　 根據(jù)稻瘟菌Moapl突變體轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)

6、庫,從中發(fā)現(xiàn)一個下調(diào)表達(dá)的乙?；D(zhuǎn)移酶編碼基因Moact。它編碼一個含271個氨基酸的蛋白質(zhì)。該基因敲除后導(dǎo)致生長速率顯著降低,同時對外源的H2O2脅迫表現(xiàn)敏感；敲除突變體胞外漆酶和過氧化物酶活性活顯著下降；突變體在CM和產(chǎn)孢培養(yǎng)基上均不產(chǎn)氣生菌絲,也不產(chǎn)生分生孢子。使用突變體菌絲塊創(chuàng)傷和無創(chuàng)傷接種水稻葉片,均不能引起水稻葉片發(fā)病。進(jìn)一步在洋蔥表皮上測定了突變體菌絲的穿透能力,發(fā)現(xiàn)突變體菌絲在洋蔥表皮細(xì)胞上形成附著胞的能力較野生型菌株顯

7、著降低,且形成的附著胞不能穿透洋蔥細(xì)胞壁；突變體注射接種可在水稻葉片上形成很小且不能擴展的壞死斑。上述結(jié)果表明,Moact參與調(diào)控稻瘟病菌的侵入及侵入后侵染菌絲的擴展,從而控制稻瘟病菌對水稻的致病性。
　　 從稻瘟病菌Moapl突變體轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中發(fā)現(xiàn)一個與粟酒裂殖酵母bZIP轉(zhuǎn)錄因子ATF/CREB高度同源且轉(zhuǎn)錄明顯上調(diào)的基因Moatfl,并對其生物學(xué)功能進(jìn)行研究。與野生型菌株相比,Moatfl敲除突變體生長速率顯著降低,對過

8、氧化氫表現(xiàn)敏感；突變體降低了對水稻敏感品種CO-39的致病性。突變體分生孢子接種水稻葉鞘72 h后,其多數(shù)侵染菌絲生長畸形,并不能在初始侵染的細(xì)胞中擴展,且水稻被突變體侵染后其體內(nèi)防衛(wèi)相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄明顯上調(diào),DAB染色觀察到被突變體侵染的水稻葉鞘細(xì)胞及突變體附著胞周圍的葉鞘細(xì)胞均積累了大量H2O2,而野生型菌株侵染時卻未發(fā)現(xiàn)類似的現(xiàn)象,表明突變體可激活水稻的防衛(wèi)反應(yīng).而采用ROS產(chǎn)生的特異性抑制劑DPI抑制水稻葉鞘細(xì)胞產(chǎn)生ROS后,突變體

9、形成的侵染菌絲在葉鞘細(xì)胞中可以恢復(fù)擴展；突變體胞外漆酶和過氧化物酶活性顯著下調(diào),Real-time PCR檢測到突變體胞外漆酶和過氧化物酶基因的轉(zhuǎn)錄量較野生型菌株顯著下降,但由于突變體對外源鹽脅迫和細(xì)胞壁脅迫沒有變化,表明Moatfl突變體侵染菌絲在水稻細(xì)胞內(nèi)擴展受阻是其誘發(fā)積累的ROS引起的,而不是突變體對外界的脅迫耐受性降低產(chǎn)生的。上述結(jié)果提示,稻瘟菌轉(zhuǎn)錄因子Moatfl可能通過調(diào)控過氧化物酶和漆酶的轉(zhuǎn)錄來消除水稻的ROS,從而抑制