中華鱉虹彩病毒單克隆抗體的制備、特性分析及應用研究.pdf

1、以純化的中華鱉虹彩病毒為抗原免疫Balb/C小鼠，經(jīng)細胞雜交融合、篩選，制備出分泌抗中華鱉虹彩病毒特異性單克隆抗體的細胞系，分析了中華鱉虹彩病毒單克隆抗體的免疫生物學特性，建立了能夠用于檢測中華鱉虹彩病毒的ELISA、IFA方法，應用中華鱉虹彩病毒單克隆抗體對蛙虹彩病毒屬STIV、RGV、FJIV三株病毒的抗原性進行了初步的比較分析。獲得如下結(jié)果： 1、中華鱉虹彩病毒的提取與純化：對中華鱉虹彩病毒的三種不同的純化方法進行比較分析

2、，結(jié)果表明兩次凍融后差速離心的方法純化病毒純度差，回收率較低；磁力攪拌加上超聲處理后差速離心可以提高病毒粒子的回收率，但容易造成病毒結(jié)構(gòu)破壞；勻漿、磁力攪拌，差速離心結(jié)合蔗糖密度梯度離心方法可獲得高純度的病毒樣品，電鏡觀察和SDS-PAGE分析進一步證實最后一種方法提純的病毒純度高、結(jié)構(gòu)完好，可用于免疫Balb/C鼠。 2、中華鱉虹彩病毒單克隆抗體的制備：以純化的中華鱉虹彩病毒抗原免疫Balb/C小鼠，取免疫小鼠脾細胞與SP2/

3、0骨髓瘤細胞進行雜交融合，經(jīng)過初篩、復篩和三次有限稀釋法克隆，獲得8個能穩(wěn)定分泌抗中華鱉虹彩病毒特異性單克隆抗體雜交瘤細胞株，分別命名為Mab2A4、Mab8E1、Mab1D3、Mab2H1、Mab3A1、Mab485、Mab5E1和Mab6F2。 3、中華鱉虹彩病毒單克隆抗體免疫生物學特性分析：單克隆抗體亞級份分析結(jié)果表明，Mab2A4屬IgA，Mab8E1是IgG2a，其他的6株單抗1D3、2H1、3A1、485、5E1和6

4、F2的亞級份均為IgG1。ELISA分析表明，8株單抗均能特異性地識別中華鱉虹彩病毒抗原，與EPC、Co、FHM等宿主細胞抗原不產(chǎn)生任何交叉反應，腹水抗體的ELISA效價在10-4～10-6之間。IFA分析表明，8株單抗中僅Mab5E1沒有免疫熒光反應特性，其余7株單抗均能對染毒病灶產(chǎn)生特異性的熒光染色。中和試驗結(jié)果證實8株單抗均沒有中和病毒的特性。Western-blot結(jié)果顯示，Mab1D3和Mab2A4分別識別分子量為84kDa和

5、35kDa中華鱉虹彩病毒結(jié)構(gòu)蛋白，Mab3A1能夠同時識別分子量分別為14kDa、15kDa和16kDa的三條多肽，其余單抗不具備Western-blot反應特性。這些結(jié)果提示上述單抗對中華鱉虹彩病毒抗原高度特異、靈敏，可用于中華鱉虹彩病毒的檢測和結(jié)構(gòu)蛋白分析。 4、單克隆抗體在虹彩病毒研究中的應用：應用中華鱉虹彩病毒單克隆抗體對蛙病毒屬的STIV、RGV、FJIV三株病毒進行交叉反應，結(jié)果表明8株單抗與三種不同來源的蛙病毒抗原

6、均有ELISA反應特性，除了Mab5E1外，其余單抗與三種不同來源的蛙病毒抗原均有IFA反應特性。結(jié)果表明蛙病毒屬的STIV、RGV、FJIV三株病毒抗原性高度一致，可能提示蛙病毒屬屬特異性抗原位點高度保守。 虹彩病毒結(jié)構(gòu)復雜，揭示虹彩病毒的致病和免疫機理難度大。中華鱉虹彩病毒單克隆抗體的成功制備為分析蛙病毒屬病毒的結(jié)構(gòu)蛋白與功能，病毒復制、裝配，以及侵染宿主和康復過程病毒粒子的分布與消長提供了十分有用的工具，并奠定重要的技術基