狂犬病病毒單克隆抗體的制備及初步應(yīng)用研究.pdf

1、狂犬病是由狂犬病毒引起的一種嚴(yán)重侵害大腦中樞神經(jīng)的重要人畜共患傳染病,一旦發(fā)病,死亡率幾乎是100％。據(jù)世界衛(wèi)生組織報(bào)道,全世界每年因狂犬病導(dǎo)致的死亡人數(shù)為5～6萬(wàn)人,而絕大多數(shù)疫情出現(xiàn)在發(fā)展中國(guó)家,其中主要在亞洲和非洲。我國(guó)在世界上屬狂犬病高發(fā)地區(qū),發(fā)病和死亡人數(shù)僅次于印度,居世界第二位。
　　 引起狂犬病的病原是狂犬病病毒。它屬于彈狀病毒科、狂犬病毒屬,為單鏈、負(fù)股的RNA病毒;狂犬病毒有5段基因分別編碼5種結(jié)構(gòu)蛋白,分別為

2、核蛋白、糖蛋白、磷蛋白、基質(zhì)蛋白和轉(zhuǎn)錄酶大蛋白。單克隆抗體具有高度特異性、均一性、高效性和無(wú)限供應(yīng)性等特點(diǎn),在狂犬病的檢測(cè)、診斷、治療以及狂犬病毒抗原表位分布及抗原變異等方面發(fā)揮著越來(lái)越重要的作用.本研究的目的是獲得一組穩(wěn)定、特異、高效的單克隆抗體,并以此建立狂犬病病毒檢測(cè)方法.
　　 本研究首先以醋酸鋅沉淀狂犬病毒細(xì)胞培養(yǎng)上清,然后蔗糖密度梯度離心,收取病毒。經(jīng)測(cè)定,病毒蛋白的含量可達(dá)到大約8.7mg.ml-1。以純化的狂犬病

3、病毒按照每只50ug的劑量免疫Balb/c小鼠,共免疫三次,檢測(cè)合格后,取免疫小鼠脾細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行融合,經(jīng)間接ELISA和IFA篩選、多次融合、培養(yǎng)、篩選和亞克隆等程序后,我們獲得了8株具有高特異性、高效價(jià)且穩(wěn)定的抗狂犬病毒的單克隆抗體,分別為:1G8、4G11、4C1、4E1、3A2、3B4、6C4和8D4,其中1G8、4G11兩株雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清效價(jià)分別為1∶512和1∶256,小鼠腹水效價(jià)分別為2.4×104和3

4、.6×104。用BCA試劑盒方法測(cè)定兩株純化腹水的蛋白含量分別為1.78 mg/ml和1.00 mg/ml,二者的亞類分別為IgG2a和IgG2b,其余株待測(cè)（正在制備腹水）。ELISA和IFA結(jié)果顯示,2株單抗均為抗狂犬病病毒糖蛋白的特異性單克隆抗體.經(jīng)過(guò)中和試驗(yàn)測(cè)定,1G8和4G11具有中和活性。相加ELISA試驗(yàn)表明,兩株單抗識(shí)別不同的抗原表位。
　　 我們成功地對(duì)單克隆抗體1G8株進(jìn)行了熒光素(FITC)的標(biāo)記,用1G8