馬鈴薯S病毒和馬鈴薯Y病毒單克隆抗體的制備及應(yīng)用.pdf

1、馬鈴薯是世界第四大糧食作物，僅次于小麥、水稻、玉米，而馬鈴薯病毒是危害馬鈴薯的主要病原，且常以復合侵染的方式危害馬鈴薯。麝香石竹潛隱病毒屬的馬鈴薯S病毒(Potato virus S，PVS)和馬鈴薯Y病毒屬的馬鈴薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)是危害馬鈴薯的兩種重要病毒，對馬鈴薯的生產(chǎn)造成巨大的經(jīng)濟損失。目前，對于馬鈴薯病毒病最主要的防治手段是通過種植脫毒種薯，而建立準確、快速、經(jīng)濟、高通量的檢測技術(shù)是生產(chǎn)脫毒種薯的關(guān)

2、鍵。以單抗為核心的血清學檢測技術(shù)具有操作簡便、快速、準確、經(jīng)濟、高通量等特點，是目前植物病毒最主要的檢測和診斷技術(shù)。為了建立PVS和PVY的快速、實用檢測技術(shù)，本論文分別制備了PVS和PVY的特異性單抗，并以單抗為核心分別建立了這兩種病毒特異、靈敏的血清學檢測方法，從而為中國馬鈴薯病毒的檢測、檢疫以及無毒種薯的生產(chǎn)和科學防控體系的建立提供技術(shù)和物質(zhì)支持。
　　(1)PVS單克隆抗體的制備及其檢測應(yīng)用:以提純的PVS病毒粒子作為免疫

3、原免疫BALB/c小鼠，通過雜交瘤技術(shù)獲得了5株能穩(wěn)定傳代并分泌PVS單克隆抗體的雜交瘤細胞株(1A3、16C10、18A9、20B12、22H4)。雜交瘤細胞分泌的單抗腹水間接ELISA效價均達到10-6以上。通過Western blot分析推測這5株單抗均與PVS的外殼蛋白有特異性反應(yīng)。以制備的單抗為核心建立了檢測馬鈴薯植株中PVS的ACP-ELISA、DAS-ELISA、dot-ELISA和Tissue blot-ELISA4種血

4、清學方法。特異性分析結(jié)果顯示，這4種血清學方法檢測感染PVS的馬鈴薯植株呈陽性反應(yīng)，而檢測健康的馬鈴薯及感染其他4種馬鈴薯病毒的植株呈陰性反應(yīng)。靈敏度分析結(jié)果表明，ACP-ELISA、 DAS-ELISA和dot-ELISA檢測馬鈴薯病葉的靈敏度分別達到1∶81920，1∶163840和1∶10240倍稀釋(w/v,g/mL)。用建立的血清學方法對2015年采自云南的22個田間馬鈴薯樣品進行檢測，檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，其中14個檢測樣品感染PV

5、S，且該檢測結(jié)果與RT-PCR的檢測結(jié)果一致，PCR產(chǎn)物的核酸序列分析表明，血清學方法檢測的陽性樣品中確實含有PVS。
　　(2)PVY單克隆抗體的制備及其檢測應(yīng)用:以提純的PVY病毒粒子免疫BALB/c小鼠，通過雜交瘤技術(shù)獲得了4株能穩(wěn)定傳代并分泌PVY單克隆抗體的雜交瘤細胞株(3B2、3E4、20B2、25C2)。雜交瘤細胞分泌的單抗腹水間接ELISA效價達到10-6以上。通過Western blot分析推測3B2、3FA和2

6、0B23株單抗可能與PVY的外殼蛋白有特異性反應(yīng)，而25C2單抗與感染PVY的病葉組織中大小約55kDa的蛋白有特異性反應(yīng)，根據(jù)分子量推測25C2單抗針對的抗原可能是HC-Pro蛋白或者VPg前體。以制備的單抗為核心建立了檢測植株中PVY的ACP-ELISA、dot-ELISA、Tissue blot-ELISA和IC-RT-PCR4種血清學方法。特異性分析結(jié)果顯示，這4種血清學方法檢測感染PVY的樣品呈陽性反應(yīng)，而與健康的煙草、馬鈴薯

7、及感染其他4種馬鈴薯病毒的植株呈陰性反應(yīng)。靈敏度分析結(jié)果表明，ACP-ELISA和dot-ELISA檢測馬鈴薯病葉的靈敏度分別達1∶81920和1∶10240倍稀釋(w/v, g/mL)，而具有最高檢測靈敏度的IC-RT-PCR方法在感病植物組織稀釋到1∶5242880倍(w/v, g/mL)時仍能檢測到病毒。用建立的血清學方法對2015年采自云南的30個田間馬鈴薯樣品進行檢測，檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，其中有20樣品感染PVY，且建立的血清學方法