牙鲆淋巴囊腫病毒單克隆抗體的研制及應(yīng)用.pdf

1、淋巴囊腫病(Iymphocystis disease LCD)是一種世界范圍流行的魚類病毒病，病原是淋巴囊腫病毒(Iymphocystis disease virus，LCDV)?；疾◆~的主要癥狀是體表長有皮膚瘤狀和菜花狀的贅生物，喪失商品價值。自1997年在威海地區(qū)養(yǎng)殖的牙鲆中首次發(fā)生以來，該病迅速蔓延至浙江、遼寧、河北等省沿海地區(qū)。近年來該病一直在養(yǎng)殖牙鲆中流行，給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成的經(jīng)濟損失高達數(shù)百億元之巨。 本論文對淋巴囊腫

2、病毒純化方法、病毒結(jié)構(gòu)蛋白及其抗原性、單克隆抗體的制備、病毒培養(yǎng)及其感染牙鲆鰓細胞的動態(tài)變化進行了研究，取得了以下結(jié)果：優(yōu)化了病毒的提純方法并使之程序化；判定病毒結(jié)構(gòu)蛋白帶共有22條，且三條蛋白帶具有抗原性；制備了單克隆抗體，并應(yīng)用多種免疫學方法證實了單抗針對病毒的特異性，確認了五個蛋白為病毒的衣殼蛋白，并且在這五個蛋白多肽上具有線形抗原決定簇；發(fā)現(xiàn)病毒感染鰓細胞后24小時之內(nèi)，開始復制，48-72小時達到頂峰。 優(yōu)化的LCDV

3、病毒提純的方法為：首先剝離囊腫組織表面的薄膜，然后采用多次勻漿處理腫瘤組織，爾后將組織勻漿液于650xg和1 800xg分別離心20 min，將離心獲得的上清液配成30[％](W／W)蔗糖溶液，4℃條件下進行78，500×g，1 80 min超速離心，病毒沉淀用TNE緩沖液重懸后進行蔗糖密度梯度離心即可。純化的LCDV病毒負染后，電鏡觀察發(fā)現(xiàn)其呈近似于圓形的多角形，結(jié)構(gòu)完整。LCDV病毒經(jīng)SDS-PAGE，硝酸銀染色，電泳圖譜清晰顯示其

4、結(jié)構(gòu)蛋白共有22條，且分子量主要集中在123-26 kDa之間。應(yīng)用兔抗LCDV血清分析結(jié)構(gòu)蛋白的抗原性，結(jié)果顯示分子量為123.55、65.292和54.438 kDa的3條蛋白帶發(fā)生了免疫反應(yīng)，其中分子量為65.292 kDa的蛋白帶反應(yīng)強度明顯高于其它2條蛋白帶。 以純化的LCDV為抗原免疫：Balb/C小鼠，采用單克隆抗體技術(shù)經(jīng)細胞融合、篩選、有限稀釋法克隆共獲得了1 3株單克隆抗體(1A8、1D7、286、2F6、2D

5、11、2G6、3A5、3G3、3D6、3G12、4C8、4D9、486)。ELISA初步篩選結(jié)果顯示，這13株雜交瘤細胞分泌的抗體的吸光值相對于其他陽性雜交瘤細胞的較高，免疫熒光抗體技術(shù)篩選結(jié)果顯示特異性塊狀熒光信號集中在囊腫細胞的細胞質(zhì)邊緣部分,且多個熒光信號相連呈現(xiàn)鏈圈狀。采用Western blotting方法對單抗特異性結(jié)合的病毒蛋白多肽的分子量進行了測定。結(jié)果顯示單抗1D7、286能識別一條分子量約為116 kDa蛋白多肽;單

6、抗3G3與兩條蛋白多肽反應(yīng),分子量分別為116kDa和90kDa;單抗3D6與分子量約為46kDa和65kDa的兩條多肽反應(yīng);單抗4C8能識別一條分子量約為35kDa蛋白多肽;單抗1A8、2F6、2D11、2G6、3A5、3G12、4D9、486沒有反應(yīng)條帶;應(yīng)用金標免疫電鏡技術(shù)定位克隆的13株單抗識別的抗原決定簇,結(jié)果發(fā)現(xiàn)膠體金顆粒集中吸附在LCDV病毒粒子囊膜周圍,且背景清潔,無散在的金顆粒或其他污染物,該結(jié)果直接證明這13株單抗的

7、抗原決定簇均位于LCDV病毒核衣殼上。結(jié)合免疫電鏡和Westernblotting結(jié)果,可以斷定分子量為116 KDa、90kDa、65kDa、46kDa和35kDa的蛋白多肽為淋巴囊腫病毒衣殼蛋白,并且具有線性抗原決定簇。 另外以LCDV病毒粗提液感染牙鲆鰓細胞系,1～2天出現(xiàn)明顯細胞病變現(xiàn)象(CPE)。以抗LCDV病毒單抗為第一抗體,運用免疫熒光抗體方法、免疫細胞化學在接種病毒的鰓細胞中檢出陽性,證實了牙鲆鰓細胞系為淋巴囊腫