對蝦白斑癥病毒囊膜蛋白單克隆抗體的研制及中和抗體篩選.pdf

1、白斑癥病毒(WSSV)病是危害對蝦養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展的主要疾病之一，十余年來國內(nèi)外學者已對其進行了大量研究。由于WSSV的囊膜與靶細胞相互作用從而介導病毒對宿主的感染，因此探明這一機理并進而阻斷，成為防控WSSV感染的重要途徑。本文通過抗WSSV不同囊膜蛋白單克隆抗體的研制，分別獲得了抗VP28，VP26及VP19線性表位的單抗；通過WSSV囊膜蛋白單克隆抗體對WSSV的體內(nèi)與體外中和，篩選得到兩株具明顯病毒中和作用的抗VP28單抗；應用抗

2、VP28單抗檢測分析VP28與宿主細胞的作用關(guān)系，論證了其在WSSV感染中的作用：另外，論文通過單抗標記及流式細胞術(shù)檢測螯蝦血細胞內(nèi)的WSSV，分析了機體感染進程中WSSV對血細胞的感染規(guī)律。具體研究內(nèi)容和結(jié)果如下： (1)WSSV囊膜蛋白單抗的研制。差速離心和蔗糖密度梯度離心從對蝦鰓組織中分離獲得WSSV，之后通過SDS-PAGE、切膠、蛋白洗脫方式分離獲得病毒系列蛋白(VP31、VP28、VP26、VP19、以及VP76和V

3、P51左右蛋白)。以獲得的病毒蛋白為抗原免疫Balb/C小鼠，采用單克隆抗體技術(shù)經(jīng)細胞融合、篩選、有限稀釋法克隆共獲得3種抗WSSV囊膜蛋白線性表位的單抗，其中抗VP28單抗8株(1D6、2C8、2G3、2H5、3A6、3E1、485、5D2)，抗VP26單抗3株(2D10、3G7、3H9)，抗VP19單抗2株(2C7、2E9)。間接免疫熒光證明各株單抗均與感染W(wǎng)SSV的蝦鰓切片呈特異性反應；Western-blot實驗證明上述三組單抗

4、所結(jié)合的抗原決定簇分別位于WSSV的VP28、VP26以及VP19上；抗體的亞型分析測定結(jié)果表明：單抗lD6，2G3，2H5，3.A6，3E1，485，5D2，3G7，3H9，2C7和2E9屬IgG亞型：單抗2C8和2D10屬IgM亞型。 (2)單抗對WSSV的體內(nèi)中和。以克氏原螯蝦(Cambarus proclarkii)動物模型檢測WSSV各囊膜蛋白單抗的中和效果。從自然感染的對蝦組織中粗提WSSV，將病毒液作一定濃度稀釋后

5、與單抗1:1孵育2h，之后皮下注射克氏原螯蝦(50μl/只)，觀察記錄螯蝦的死亡情況。結(jié)果顯示2株VP28單抗(1D6，2G3)與病毒混合作用后感染的螯蝦組出現(xiàn)死亡的時間(4d，3d)和達到100％死亡率的時間(13d，12d)比對照組(注射未經(jīng)單抗作用病毒，1d，7d)明顯延遲，其他單抗組與對照組相近或稍有提前。結(jié)果表明1D6和2G3可明顯延緩WSSV對宿主的感染，部分中和了WSSV的感染力。 (3)單抗對WSSV的體外中和。

6、通過ELISA實驗分析單抗對WSSV與對蝦血細胞膜結(jié)合的阻斷效果驗證單抗的中和性。提取中國對蝦(Fenneropenaeus chinensis)血細胞膜并對WSSV進行地高辛(DIG)標記，將病毒和各單抗混合作用后吸附對蝦血細胞膜，使用抗地高辛抗體檢測結(jié)合到血細胞膜上的病毒。結(jié)果顯示單抗1D6，2G3組WSSV的結(jié)合量(OD值：0.207，0.235)明顯低于對照組(病毒未與單抗作用，OD值：0.401)，其它單抗組與對照組差異不明顯

7、。結(jié)果表明單抗1D6，2G3可以明顯降低WSSV和血細胞膜的結(jié)合，通過阻礙WSSV與宿主細胞的結(jié)合進而延緩病毒感染，兩株單抗均具有部分中和作用。 (4)VP28與靶細胞作用關(guān)系的分析。中國對蝦血細胞與提純的VP28作用后，應用VP28單抗進行免疫熒光染色，結(jié)果顯示對蝦血細胞與VP28作用后細胞邊緣呈現(xiàn)特異性熒光亮點：中國對蝦血細胞膜與提純的VP28作用后，應用VP28單抗進行ELISA實驗，結(jié)果顯示呈現(xiàn)陽性反應；對蝦血細胞電泳轉(zhuǎn)

8、移至硝酸纖維素膜，鋪覆VP28作用后，應用VP28單抗進行免疫印跡試驗，結(jié)果顯示VP28與中國對蝦血細胞膜上的72kDa蛋白結(jié)合。以上三項實驗均表明洗脫提純的VP28可與對蝦血細胞膜特異性結(jié)合，其通過與宿主細胞的黏附作用介導病毒感染，同時推測VP28作用的關(guān)鍵位點為線性結(jié)構(gòu)。 (5)WSSV對克氏原螯蝦血細胞的感染。通過皮下注射WSSV感染螯蝦后每24h收集血細胞，經(jīng)WSSV單抗及熒光二抗染色后應用流式細胞儀檢測，同時記錄累積死

9、亡率及血細胞密度。結(jié)果顯示感染后1-5天：螯蝦的累積死亡率為3.3，13.3，16.7，36.7，70.0(％)：血細胞被感染比例為6.47，6.93，10.65，26.08，4.94(％)：被感染細胞平均熒光強度為10.7，10.89，11.7l，13.77，15.47：血細胞密度(×106個/ml)為7.56±0.30，5.60±0.24，4.2l±0.30，1.45±0.26，1.21±0.21(未感染為5.34±0.22)。以上

10、結(jié)果表明，在機體感染進程中，螯蝦血細胞密度呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢，至后期僅為感染前的1/5；血細胞被感染率同時也呈現(xiàn)了先上升后下降的變化趨勢，但被感染血細胞中的病毒量則始終呈上升趨勢；血細胞處于最高感染率時機體瀕臨死亡，表明血細胞的WSSV感染程度與機體的感染狀況密切相關(guān)。 綜上，本論文在獲得WSSV多種囊膜蛋白單克隆抗體的基礎上，成功篩選到兩株能夠明顯中和WSSV的單抗，這為進一步應用中和抗體阻斷WSSV感染提供了工具：同時，