用對(duì)蝦血細(xì)胞單克隆抗體研究分析白斑癥病毒的受體.pdf

1、通過(guò)白斑癥病毒(WSSV)與對(duì)蝦血細(xì)胞膜的體外結(jié)合方法和對(duì)蝦血細(xì)胞原代培養(yǎng)的方法，從研制出的抗對(duì)蝦血細(xì)胞的單克隆抗體中，篩選出抗WSSV受體的單克隆抗體，并用Westernblot和親和層析方法鑒定了WSSV受體的分子量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下：利用WSSV和對(duì)蝦血細(xì)胞膜體外結(jié)合的DOTBLOT方法，從抗中國(guó)對(duì)蝦血細(xì)胞的單克隆抗體中篩選出單克隆抗體4D8具有部分封閉WSSV和對(duì)蝦血細(xì)胞膜結(jié)合的作用。對(duì)蝦血細(xì)胞膜和有部分封閉作用的單克隆抗體4D8反

2、應(yīng)，再和地高辛標(biāo)記的WSSV(WSSV-DIG)孵育，由于部分受體被封閉使WSSV-DIG無(wú)法與其結(jié)合，由DOTBLOT得到的結(jié)果顏色較淺；對(duì)蝦血細(xì)胞膜和無(wú)封閉作用的單克隆抗體反應(yīng)，再和WSSV-DIG孵育，由于WSSV-DIG與對(duì)蝦血細(xì)胞膜上的所有受體結(jié)合，由DOTBLOT得到的結(jié)果顏色較深。 利用WSSV和對(duì)蝦血細(xì)胞膜體外結(jié)合的ELISA方法，對(duì)單克隆抗體4D8的封閉效果進(jìn)行了定量分析。對(duì)蝦血細(xì)胞膜和無(wú)封閉作用的單克隆抗體反

3、應(yīng)，再和WSSV-DIG孵育，由于WSSV-DIG與對(duì)蝦血細(xì)胞膜上的所有受體結(jié)合，由ELISA得到的OD值較大，為0.423；對(duì)蝦血細(xì)胞膜和有封閉作用的單克隆抗體4D8反應(yīng)，再和WSSV-DIG孵育，由于部分受體被封閉使WSSV-DIG無(wú)法與其結(jié)合，由ELISA得到的OD值較小，為0.256，占受體不被封閉所得OD值的41％。 用對(duì)蝦血細(xì)胞原代培養(yǎng)的方法對(duì)單克隆抗體4D8的封閉效果進(jìn)一步驗(yàn)證：與無(wú)封閉作用的單克隆抗體孵育的原代培

4、養(yǎng)的血細(xì)胞，經(jīng)WSSV感染后，第3天就表現(xiàn)出了病理變化；與有封閉作用的單克隆抗體4D8孵育的原代培養(yǎng)的血細(xì)胞，經(jīng)WSSV感染后，出現(xiàn)病理變化較晚，第5天才表現(xiàn)出了病理變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：?jiǎn)慰寺】贵w4D8能封閉部分WSSV受體，從而延緩了WSSV對(duì)原代培養(yǎng)血細(xì)胞的感染進(jìn)程。 經(jīng)Westernblot和親和層析技術(shù)鑒定，抗WSSV受體的單克隆抗體4D8在中國(guó)對(duì)蝦血細(xì)胞膜上識(shí)別的WSSV受體的分子量為175kDa。單克隆抗體4D8在日

5、本對(duì)蝦血細(xì)胞上識(shí)別的抗原決定簇分子量為175kDa，在凡納濱對(duì)蝦血細(xì)胞上識(shí)別的抗原決定簇分子量為200kDa，在克氏原螯蝦血細(xì)胞上識(shí)別的抗原決定簇分子量為200kDa。 抗大顆粒細(xì)胞的單克隆抗體1B4與WSSV感染的對(duì)蝦血細(xì)胞反應(yīng)并經(jīng)過(guò)蘇木精溶液襯染后，通過(guò)顯微鏡觀察統(tǒng)計(jì)每個(gè)視野的細(xì)胞數(shù)量：在感染的第1、2、3天，WSSV感染組凡納濱對(duì)蝦的血細(xì)胞總數(shù)呈逐漸上升的趨勢(shì)，大顆粒細(xì)胞占血細(xì)胞總數(shù)的比例增加較大。在隨后的幾天，血細(xì)胞總數(shù)

6、顯著下降；大顆粒細(xì)胞的數(shù)量也呈下降的趨勢(shì)；大顆粒細(xì)胞占血細(xì)胞總數(shù)的比例，從第3天的45.9％下降到第8天的43.3％，但仍明顯高于第1天的15.2％。 通過(guò)免疫熒光檢測(cè)技術(shù)，抗凡納濱對(duì)蝦三類血細(xì)胞的單克隆抗體1B4與凡納濱對(duì)蝦胚胎的冰凍切片反應(yīng)：早期的胚胎呈現(xiàn)出點(diǎn)點(diǎn)的明亮熒光，說(shuō)明凡納濱對(duì)蝦在胚胎發(fā)育期就已有了成蝦血細(xì)胞的組分。用抗凡納濱對(duì)蝦大顆粒細(xì)胞的單克隆抗體1H11檢測(cè)胚胎和無(wú)節(jié)幼體各期的冰凍切片，發(fā)現(xiàn)從蚤狀幼體Ⅲ期才開始