對蝦白斑癥病毒和魚類淋巴囊腫病毒檢測抗體芯片的制備與應用.pdf

1、病毒性疾病嚴重威脅著水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的健康快速發(fā)展。鑒于目前病毒病尚無有效的治療方法,病毒的早期準確檢測對疾病的預防和控制尤為重要,因此建立一種多樣品、多指標檢驗并行處理的簡便、快速、靈敏、準確的病毒檢測方法對病毒病的防控具有重要意義。新興的抗體芯片技術結合了抗原抗體反應的特異性和芯片高密度集成優(yōu)勢,只需少量生物樣品,一次檢測便可獲得幾種甚至幾萬種有關的生物信息或疾病的檢測結果,在人類疾病中病原/疾病標志物等的檢測上已顯示出廣闊的應用前景。但

2、尚未發(fā)現(xiàn)有利用抗體芯片法檢測水產(chǎn)動物病毒的相關報道。本文將單克隆抗體(單抗)技術、免疫標記技術和抗體芯片技術相結合,以目前水產(chǎn)養(yǎng)殖中的重要病毒病的病原對蝦白斑癥病毒(White Spot SyndromeVirus,WSSV)和魚類淋巴囊腫病毒(Lymphoeystis Disease Virus,LCDV)為模式病毒,建立了水產(chǎn)動物病毒檢測抗體芯片制備體系,優(yōu)選了芯片載體,優(yōu)化了反應條件,研究了點樣緩沖液、抗體濃度、固定時間、封閉劑種

3、類和濃度、抗原.抗體反應時間、不同標記顯色方法等對芯片靈敏度的影響,制備了對蝦WSSV檢測抗體芯片和魚類LCDV檢測抗體芯片,并將其用于WSSV/LCDV的檢測。具體研究結果如下:
　　 1.針對芯片載體的選擇和處理是制備高質量抗體芯片的關鍵,本文制備了瓊脂糖凝膠、丙烯酰胺凝膠、APES、醛基、巰基、多聚賴氨酸修飾玻片,綜合分析了以上6種不同修飾的玻片及氨基化玻片、硝酸纖維素(NC)膜、PVDF膜共9種不同載體對抗體的固定效率和

4、效果。結果顯示1.2％瓊脂糖凝膠修飾玻片表面信號點圓潤、均勻,無邊緣擴散和拖尾現(xiàn)象,信號值最高,而其他載體都有不同程度的拖尾現(xiàn)象,表明瓊脂糖凝膠修飾玻片對抗體的固定能力和固定效果最好。原子力顯微鏡顯示瓊脂糖凝膠修飾玻片表面為均勻的三維多孔結構,平均表面粗糙度為18.6 nm,結合瓊脂糖凝膠表面經(jīng)NaIO4活化后的醛基基團,能夠以物理吸附和共價結合的方式牢固的固定抗體。因此后續(xù)實驗采取瓊脂糖凝膠修飾玻片作為抗體芯片的載體。
　　

5、2.以WSSV/LCDV病毒粒子為模式病毒,采用雙抗體夾心方式建立了水產(chǎn)動物病毒的抗體芯片檢測體系。提純WSSV/LCDV病毒粒子,制備病毒的兔抗血清,純化后進行特性分析。結果顯示純化后得到了高活性、高效價的兔抗WSSV及兔抗LCDV抗體,效價分別為1:64000和1:32000。
　　 復蘇本研究室前期制備的WSSV/LCDV單抗雜交瘤細胞株,采用腹水生產(chǎn)方法獲得大量WSSV/LCDV單抗,辛酸硫酸銨法結合Protein G親

6、和層析純化后進行特性分析。結果顯示純化后WSSV/LCDV單抗效價均為1:32000,具很好的活性。采用Cy3抗體標記試劑盒(GE)對純化后的高效價單抗作Cy3標記,制備了特異性檢測WSSV/LCDV的抗體探針,Cy3標記后WSSV/LCDV單抗探針的工作濃度分別為1:2400和1:3000。
　　 3.以制備的兔抗WSSV/LCDV多克隆抗體為捕獲抗體,用小型手動芯片點樣系統(tǒng)將其點樣于優(yōu)選的瓊脂糖凝膠修飾的芯片載體上,制備WS

7、SV/LCDV檢測抗體芯片。選用特異性強的Cy3標記的WSSV/LCDV單抗為檢測抗體?？贵w芯片與WSSV/LCDV病毒稀釋液孵育形成復合物,該復合物被Cy3標記的特異性WSSV/LCDV單抗探針識別,經(jīng)CCD芯片掃描儀讀取結果。通過改變芯片制備及應用過程中的具體條件參數(shù),對點樣緩沖液、點樣抗體濃度、固定時間、封閉劑種類和濃度、洗滌方法、抗原-抗體反應時間、不同標記顯色方法進行了優(yōu)化,得到芯片制備與應用的最佳條件。結果顯示,點樣用捕獲抗

8、體采用含50％甘油的PBS調整到合適濃度(兔抗WSSV抗體為0.1 mg/ml,兔抗LCDV抗體為0.5 mg/ml)進行點樣,點樣后芯片于37℃飽和濕度固定2 h,3％牛血清白蛋白于37℃飽和濕度封閉1 h,依次用dH2O、PBST、PBST洗滌,每次5 min,甩干后低溫密封保存。芯片與捕獲抗體的反應時間為15～30 min,檢測抗體與芯片上的抗原抗體復合物的反應時間15～30 min,不要超過45 min。
　　 4.研究

9、了不同載體、不同標記物(包括辣根過氧化物酶(HRP),Cy3,異硫氰酸熒光素(FITC),膠體金和生物素)標記單抗用作檢測抗體、芯片保存時間等對檢測靈敏度的影響。結果顯示,以瓊脂糖修飾玻片作為載體制備的抗體芯片,分別采用HRP和Cy3標記抗體探針作為檢測抗體,檢測靈敏度高,WSSV檢測抗體芯片的靈敏度分別為0.15μg/ml和0.31μg/ml,LCDV檢測抗體芯片的靈敏度均為0.55μg/ml。WSSV濃度在0.62μg/ml-9.9

10、μg/ml范圍內,熒光信號強度與病毒濃度的對數(shù)值與呈線性關系,相關系數(shù)為0.98925;LCDV濃度在0.55-17.56μg/ml范圍內,信號強度與病毒濃度的對數(shù)值與呈線性關系,相關系數(shù)為0.9900。檢測信號經(jīng)生物素-鏈酶親和素系統(tǒng)放大之后,靈敏度明顯提高,WSSV檢測抗體芯片可達25 ng/ml,LCDV檢測抗體芯片可達70 ng/ml。
　　 Cy3標記抗體作為檢測抗體,抗體芯片于-20℃密封保存4個月后,檢測的背景值大

11、幅升高,從而導致相對信號值的下降。HRP標記抗體作為檢測抗體,芯片于-20℃下密封保存12個月,WSSV檢測抗體芯片的檢測靈敏度不變;LCDV檢測抗體芯片靈敏度下降至1.1μ/ml。
　　 5.利用建立的抗體芯片技術平臺,制備了WSSV檢測抗體芯片和LCDV檢測抗體芯片。將抗體芯片用于對蝦WSSV和魚類LCDV樣品的檢測,檢測結果與酶聯(lián)免疫吸附實驗(Enzyme Linked Immunosor-bent Assay,ELISA

12、)比較,結果顯示W(wǎng)SSV檢測抗體芯片與ELISA檢測的結果符合率為100％,相關系數(shù)為0.9853;LCDV檢測抗體芯片與ELISA檢測的結果符合率為100％,相關系數(shù)為0.9802。說明所制備的抗體芯片能夠準確的檢測病原,具有很好的特異性與準確性。
　　 6.將抗體芯片技術與免疫酶技術結合,采用HRP標記單抗探針作為檢測抗體,制備的WSSV/LCDV檢測抗體芯片用于對蝦WSSV與魚類LCDV的現(xiàn)場檢測,肉眼即可觀察檢測結果,解

13、決了抗體芯片結果的讀取依賴專用儀器的問題。可視化WSSV/LCDV檢測抗體芯片用于病毒現(xiàn)場檢測,操作簡便,無需昂貴儀器,準確性與IIFA法和ELISA法一致,信號值與病毒濃度的對數(shù)值呈線性關系,相關系數(shù)分別為0.9505和0.9567,可在一定范圍內對病毒進行相對定量檢測,在苗種選育、養(yǎng)殖生產(chǎn)的疾病監(jiān)測中有廣闊的應用前景。
　　 本研究所建立的抗體芯片制備體系能夠拓展到其它水產(chǎn)動物病原檢測領域,是對傳統(tǒng)免疫學檢測手段的發(fā)展。構建