魚類淋巴囊腫病毒32kDa黏附蛋白的特性分析.pdf

1、淋巴囊腫病毒(lymphocystis disease virus,LCDV)是魚類淋巴囊腫病的病原,呈世界性分布,可感染42科140種以上的淡水、半咸水和海水魚類。該病自1997年在我國山東威海地區(qū)的養(yǎng)殖牙鲆中首次暴發(fā)以來,迅速蔓延至遼寧、河北、浙江等沿海省份,給我國的魚類養(yǎng)殖業(yè)造成巨大經(jīng)濟損失。LCDV是具有囊膜的大分子DNA病毒,囊膜病毒通過囊膜上的單個或多個黏附蛋白與宿主靶細胞上的受體蛋白發(fā)生特異性結合而吸附到靶細胞表面,介導病

2、毒與細胞上的蛋白發(fā)生構型變化,促進宿主細胞膜與病毒囊膜融合,使病毒的遺傳物質進入細胞內(nèi)部進行復制。研究病毒囊膜上的黏附蛋白對于闡明病毒感染和致病的分子機制具有重要意義。
　　實驗室前期曾在牙鲆(Paralichthys olivaceus)鰓細胞(FG)上鑒定出一個分子量為27.8kDa的LCDV細胞受體蛋白,并制備了2株抗27.8kDa受體蛋白的單克隆抗體(2G11、3D9),2株抗體都能有效阻斷LCDV對FG細胞的感染。應用抗

3、27.8kDa受體蛋白單克隆抗體與Far-western技術在LCDV上發(fā)現(xiàn)一個分子量為32kDa的蛋白能夠與27.8kDa受體蛋白特異性結合,質譜鑒定結果表明該32kDa蛋白是LCDV上038開放閱讀框(Open reading frame038,ORF038)編碼的蛋白。本論文通過構建LCDV ORF038基因的原核表達載體,重組表達得到ORF038蛋白,制備了其多克隆抗體,并對該32kDa病毒蛋白進行了特性分析,證明該蛋白是LCD

4、V的黏附蛋白,在病毒入侵FG細胞中發(fā)揮重要作用,為研究LCDV感染宿主的分子機理,以及尋找阻斷病毒感染的有效途徑提供了基礎資料。具體研究結果如下:
　　根據(jù)LCDV ORF038基因序列,設計特異性引物,將ORF038基因和pET-32a表達載體進行定向克隆,構建了LCDV ORF038融合表達載體pET32a-ORF038,轉入大腸桿菌Escherichia coli表達菌BL21(DE3),親和層析柱(GE)純化重組表達蛋白,

5、獲得分子量大小為50kDa的重組表達蛋白;利用該重組蛋白免疫新西蘭白兔,制備了兔抗ORF038重組表達蛋白多克隆抗體(多抗);對LCDV總蛋白和ORF038重組表達蛋白進行SDS-PAGE電泳和Western blotting分析,結果顯示在分子量約32kDa和50kDa處出現(xiàn)特異性反應條帶,而陰性對照無條帶出現(xiàn),表明該抗體具有良好的特異性。
　　利用制備的兔抗ORF038重組蛋白血清與LCDV孵育,膠體金標記羊抗兔IgG作為二抗

6、,免疫電鏡技術定位ORF038蛋白編碼的32kDa病毒蛋白在LCDV上的分布,結果顯示,膠體金顆粒位于LCDV粒子的囊膜上,表明ORF038基因編碼的32kDa蛋白是LCDV的囊膜蛋白。利用FITC標記的LCDV ORF038重組表達蛋白與FG細胞孵育,免疫熒光實驗結果顯示,在FG細胞表面出現(xiàn)綠色陽性信號,表明該重組蛋白能夠與 FG細胞膜上的受體蛋白結合。
　　阻斷ELISA實驗發(fā)現(xiàn)ORF038重組表達蛋白可以阻斷單克隆抗體(2G

7、11、3D9)與27.8kDa受體蛋白間的結合,阻斷率為63.2％;體外感染中和實驗中,將ORF038重組表達蛋白兔多抗進行梯度稀釋,并與LCDV預孵育,然后感染FG細胞。結果發(fā)現(xiàn),隨著抗體濃度的增加,FG細胞出現(xiàn)CPE的時間相應延遲,且發(fā)生病變的細胞數(shù)量明顯降低,抑制效果與多抗?jié)舛却嬖趧┝恳蕾囆?表明該兔多抗可以有效中和LCDV,進一步證明LCDV的32kDa蛋白是病毒黏附蛋白,能夠與FG細胞上27.8kDa受體蛋白相互作用,在LC