山羊痘病毒某些生物學特性及其主要結構蛋白P32基因的研究.pdf

1、山羊痘是由羊痘病毒屬（Capripoxvirus）山羊痘病毒（Goat poxvirus，GPV）引起的一種高度接觸性傳染病，臨床上以體溫升高，全身皮膚、呼吸道和消化道黏膜出現(xiàn)痘疹為主要特征。本病被世界動物衛(wèi)生組織（OIE）列為A類重大動物傳染病，我國也將其列為一類動物疫病。2002年10月以來，貴州省羊群中首次暴發(fā)疑似山羊痘病例，并迅速波及到8個養(yǎng)羊較為集中的地區(qū)，對我省養(yǎng)羊業(yè)的健康發(fā)展構成了巨大的威脅。為了防制本病，本研究對我省兩株

2、山羊痘病毒分離株進行了某些生物學特性及其主要結構蛋白P32基因進行了詳細研究。
　　將貴州省山羊痘病毒分離株GPV-LD和GPV-QL接種Vero-E6、BHK-21細胞，3～7d感染細胞顯現(xiàn)圓縮、聚集成簇等細胞病變效應；以GPV熒光抗體對感染細胞飛片染色，在細胞漿中檢測到特異性的黃綠色熒光；取感染細胞超薄切片進行電子顯微鏡觀察，細胞漿中發(fā)現(xiàn)大量成熟和未成熟的痘病毒顆粒；將感染細胞培養(yǎng)物提取總DNA樣本，采用針對P32結構蛋白基因

3、和ITR非編碼區(qū)基因的兩對引物進行PCR鑒定，分別擴增出969bp和289bp的DNA片段，對目的DNA片段的測序結果證實感染細胞培養(yǎng)物中存在GPV特異性的病原核酸；采用2000TCID50的病毒感染細胞培養(yǎng)物通過皮下接種3月齡健康山羊，在14～45d成功復制出與山羊痘自然病例相類似的臨床癥狀和剖檢病變，并從感染組織材料中回收到接種的病毒。
　　對GPV結構蛋白P32基因和非編碼區(qū)ITR基因的兩對引物進行比較，以期開展臨床山羊痘病

4、例的定性PCR檢測。研究結果表明兩對引物具有羊痘病毒屬特異性，不與副痘病毒屬羊傳染性膿皰病毒、禽痘病毒屬雞痘病毒、健康山羊皮膚樣本發(fā)生交叉反應。貴州分離毒P32基因和ITR基因與國內外參考毒株的核苷酸同源性分別達99.5％～100％和100％；PCR最小檢出量分別為19.06ng和24.40ng。為此，ITR基因引物更適合于臨床山羊痘病例的診斷，而P32基因則有利于病毒囊膜表面蛋白的深入研究。
　　根據(jù)GPV參考毒株的全基因序列，

5、針對gp064基因分別設計與合成了TaqMan-MGB探針和引物，應用實時熒光PCR方法開展對山羊痘病例的定量檢測。一般PCR方法只能檢測患羊出現(xiàn)痘疹病變的皮膚和黏膜材料，而FQ-PCR方法則能夠從患羊鼻腔拭子、血液樣本、皮膚、肺、胃、淋巴結等組織材料中檢出GPV病原核酸。按照本試驗構建的標準曲線，TaqMan-MGB-FQ-PCR方法的檢測極限為0.1TCID50的病毒量。檢測結果表明在人工復制山羊痘病例中，不同組織的含毒量呈現(xiàn)皮膚>

6、瘤胃>肺>淋巴結的趨勢；接種山羊從第9～15d形成病毒血癥，持續(xù)時間較短；鼻拭子中從第7～22d均能檢測到病毒的存在，表明患羊痘疹痂皮和鼻分泌物是山羊痘蔓延擴散的主要傳染源。應用FQ-PCR方法在皮膚痘疹病變出現(xiàn)之前3～5d即可檢測病毒的增殖動態(tài)，為山羊痘的早期診斷提供了實用的技術。
　　對山羊痘現(xiàn)場自然病例和人工復制病例進行病理形態(tài)學觀察，患病羊群的大體病變以皮膚、呼吸道和消化道黏膜出現(xiàn)痘疹為特征；病變部位上皮細胞增生、變性，同

7、時出現(xiàn)巨噬細胞、淋巴細胞和嗜中性白細胞等炎性細胞浸潤；受害細胞胞漿內觀察到線粒體腫脹、內質網(wǎng)擴張、高爾基復合體擴張甚至破裂。在感染細胞的胞漿中觀察到大量成熟和未成熟的痘病毒顆粒，包括形態(tài)較大，被膜完整或不完整，呈C形或花瓣狀的初期病毒顆粒；在中央或偏中央部位開始形成致密類核體的中期病毒顆粒；和形態(tài)較小，有囊膜包裹，中央可見兩面凹陷呈啞鈴形核酸芯髓的成熟期痘病毒顆粒。
　　將GPV-QL、GPV-LD、GPV-Y和GPV-B毒株的P

8、32基因克隆至pMD18-T載體，重組質粒測序和序列分析顯示，GPV貴州分離株之間核苷酸同源性高達99.9％，與國內其它GPV分離株的核苷酸同源性達到99.7％～100％，與國外GPV分離株核苷酸同源性達到99.5％～99.6％。系統(tǒng)發(fā)生樹分析顯示羊痘病毒屬中SPV與LSDV之間親緣關系較近，聚為一類，而它們與GPV親緣關系較遠，后者聚為一類，不同毒株之間表現(xiàn)出明顯的種間差異和地域關系。P32蛋白的跨膜結構、親水性、抗原指數(shù)、柔韌性、表

9、面可及性和二級結構分析結果表明，GPVP32蛋白基因在肽段227-251區(qū)域存在一個潛在的優(yōu)勢抗原表位。
　　以pMD18-T-P32/LD質粒為模板，擴增P32基因不同長度的片段并克隆至表達載體，構建原核重組表達載體和真核重組表達載體，轉化至相應的宿主菌中進行誘導表達。結果表明，P32基因N端1/3片段和中間1/3片段未能通過原核表達載體pET-28a、畢赤酵母真核表達載體pPICZαA在各自宿主菌BL21(DE3)、X-33中

10、獲得表達；而P32全基因在兩種表達系統(tǒng)中均獲得了良好的表達，SDS-PAGE和Western-Blotting分析顯示表達蛋白分子量分別為35.5KD和64KD。表達蛋白通過Ni柱親和層析和Sephadex G-100層析獲得純化，該純化蛋白在瓊脂擴散試驗中與山羊痘陽性血清出現(xiàn)特異性的沉淀線，而與陰性血清不發(fā)生反應；采用純化蛋白接種家兔制備免疫血清，該免疫血清使山羊痘病毒感染力減少50％的中和指數(shù)達到1:123.07。采用純化的P32蛋