綿羊痘病毒和山羊痘病毒雙重PCR檢測(cè)方法的建立.pdf

1、羊痘是由山羊痘病毒屬病毒中的綿羊痘病毒(Sheeppoxvirus,SPPV)和山羊痘病毒(Goatpoxvirus,GTPV)所引起的羊的一種高度急性、熱性、接觸性傳染病,臨床上以發(fā)熱、皮膚出現(xiàn)痘疹、水泡或結(jié)節(jié)為主要特征。羊痘是所有動(dòng)物痘病中最為嚴(yán)重的一種,發(fā)病率為50%～80%,病死率達(dá)20%～80%,其中羔羊病死率可達(dá)100%,導(dǎo)致妊娠羊流產(chǎn),繁殖力下降,羊毛和羊皮品質(zhì)嚴(yán)重受損.給養(yǎng)羊業(yè)帶來(lái)了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。目前.羊痘已遍布世界大

2、部分的國(guó)家和地區(qū),以非洲、亞洲最為嚴(yán)重,我國(guó)多地也均有發(fā)生,有的地區(qū)呈暴發(fā)流行,并有上升趨勢(shì)。此外,還存在一定的公共衛(wèi)生安全問(wèn)題。通常認(rèn)為羊痘的感染具有宿主特異性,但越來(lái)越多的研究表明,SPPV和GTPV的某些毒株具有交叉感染性。綿羊痘和山羊痘具有十分相似的臨床癥狀和發(fā)病機(jī)理,與副痘病毒引起的病癥也有相似之處,有的病例發(fā)生繼發(fā)感染或與其他疾病混合感染,通過(guò)臨床特征很難診斷。羊痘病毒的分離培養(yǎng)和電鏡觀察特異性較強(qiáng),但耗時(shí)冗長(zhǎng),需要專(zhuān)業(yè)儀器

3、和技術(shù),不適于快速診斷和基層應(yīng)用的要求。血清學(xué)檢測(cè)方法相對(duì)簡(jiǎn)便,但機(jī)體感染羊痘主要引起細(xì)胞免疫,僅產(chǎn)生較低水平的中和抗體,且SPPV、GTPV、牛疙瘩皮膚病毒(Lumpyskindiseasevirus,LSDV)及副痘病毒間存在共同的抗原和相似血清型,因而血清學(xué)檢測(cè)方法的靈敏度和特異性不高,亦不能相互鑒別診斷。因此,建立一種快速、簡(jiǎn)捷、準(zhǔn)確的且能同時(shí)榆測(cè)綿羊痘和山羊痘的方法,對(duì)羊痘的早期診斷、疫情監(jiān)控、流行病學(xué)調(diào)查及早日消除羊痘等具有

4、重要意義。
　　 為保障養(yǎng)羊業(yè)健康發(fā)展,加快現(xiàn)代畜牧業(yè)前進(jìn)步伐,本研究從分子生物學(xué)出發(fā),以PCR方法為技術(shù)基礎(chǔ),建立了一種鑒別診斷SPPV和GTPV的以重PCR檢測(cè)辦法,主要研究?jī)?nèi)容包括以下幾個(gè)方面:
　　 1、通過(guò)對(duì)GenBank中發(fā)表的SPPV和GTPV的全基因組序列進(jìn)行分析,應(yīng)用PrimerPremier5.0生物學(xué)軟什設(shè)計(jì)出兩對(duì)引物進(jìn)行PCR反應(yīng),將擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化后連接到pMD19-T載體,構(gòu)建質(zhì)粒pM

5、D19-S和pMD19-G,質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果與GenBank中發(fā)表的基因組序列進(jìn)行比對(duì),結(jié)糶表明,兩對(duì)引物能特異性地?cái)U(kuò)增出目的片段,pMD19-S與SPPV基因組序列的相似性在98%以上,pMD19-G與GTPV基因組序列的相似性為96%。
　　 2、通過(guò)對(duì)PCR反應(yīng)體系中引物濃度、TaqDNA聚合酶濃度和退火溫度的優(yōu)化,建立了SPPV單重PCR檢測(cè)方法和GTPV單重PCR檢測(cè)方法。特異性試驗(yàn)結(jié)果表明:各單重PCR方法僅對(duì)日的基因有

6、擴(kuò)增,對(duì)其他病原或健康組織無(wú)擴(kuò)增。靈敏度試驗(yàn)結(jié)果表明:SPPV單重PCR檢測(cè)方法最低可檢測(cè)到3.45×106copies/μL的SPPV質(zhì)粒DNA,GTPV單重PCR檢測(cè)方法最低可檢測(cè)到3.42×103copjes/μL的GTPV質(zhì)粒DNA。
　　 3、在已建立的SPPV單重PCR方法和GTPV單重PCR方法的基礎(chǔ)上,通過(guò)對(duì)PCR反應(yīng)體系中引物濃度、dNTP濃度,Mg2+濃度和退火溫度進(jìn)行優(yōu)化。建立了單管同時(shí)擴(kuò)增SPPV和GTP

7、V的雙重PCR方法。特異性試驗(yàn)結(jié)果表明:該方法能特異性擴(kuò)增SPPV長(zhǎng)度為177bp和GTPV長(zhǎng)度為222bp的目的片段,對(duì)其他病原或健康組織無(wú)擴(kuò)增。靈敏度試驗(yàn)結(jié)果表明:該方法最低可檢測(cè)到1.725×107copies/μL的SPPV質(zhì)粒DNA和1.71×106copies/μL的GTPV質(zhì)粒DNA。
　　 4、分別采用病毒分離、綿羊痘和山羊痘單重PCR和雙重PCR方法對(duì)采自甘肅與重慶地區(qū)的50份疑似羊痘病料進(jìn)行檢測(cè),其陽(yáng)性檢出率

8、分別為14%、4%、10%、14%。試驗(yàn)表明:雙重PCR能區(qū)別診斷綿羊痘和山羊痘,具有更高的特異性,優(yōu)于病毒分離培養(yǎng)方法;單重PCR方法與雙重PCR的符合率為100%,單重的PCR可以用于對(duì)雙重PCR擴(kuò)增結(jié)果的驗(yàn)證。雙重PCR方法簡(jiǎn)便、快速、具有高靈敏度和特異性,可以用于臨床樣品的檢測(cè)。
　　 總之,本研究建立的雙重PCR診斷方法能對(duì)綿羊痘病毒和山羊痘病毒單個(gè)或混合感染的病毒樣品進(jìn)行快速診斷,不僅對(duì)羊痘的臨床檢測(cè)提供了科學(xué)的理論