山羊痘病毒的血清學(xué)檢測與PCR鑒定.pdf

1、本文由四部分構(gòu)成，一是制備了山羊痘正向間接血凝診斷試劑。二是采用自制的正向間接血凝診斷試劑(IHA)對貴州省鎮(zhèn)遠(yuǎn)、德江2個(gè)地區(qū)及廣西省柳州市獸防站送檢的血清樣品進(jìn)行了山羊痘免疫效果監(jiān)測。三是對山羊痘病變及山羊痘病毒進(jìn)行了比較詳細(xì)的透射電鏡觀察。四是應(yīng)用PCR技術(shù)檢測山羊痘病毒。主要試驗(yàn)和結(jié)果如下： 1.通過Vero-E6細(xì)胞盲傳3代后觀察到有規(guī)律的CPE；細(xì)胞培養(yǎng)物瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)陽性；反向間接血凝試驗(yàn)陽性；由此確定成功分離了一株貴

2、州山羊痘流行毒株，命名為LD毒株。通過硫酸銨鹽析、SephadexG-200柱層析純化山羊痘病毒，以病毒抗原致敏綿羊紅細(xì)胞制備了山羊痘正向間接血凝診斷試劑，進(jìn)行了最佳試驗(yàn)條件的摸索，并與瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)相比較，表明正向間接血凝試驗(yàn)比瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)敏感性高。本次試驗(yàn)制備的正向間接血凝試驗(yàn)診斷液可用于獸醫(yī)臨床上進(jìn)行快速診斷。 2.應(yīng)用自制的山羊痘正向間接血凝診斷試劑對貴州省和廣西柳州市共604頭份山羊血清進(jìn)行了抗體檢測。同時(shí)對三種山羊痘疫

3、苗進(jìn)行了免疫效果比較，測定了山羊痘疫苗的免疫抗體消長規(guī)律、免疫保護(hù)期，對皮內(nèi)、皮下、肌肉接種疫苗的免疫效果進(jìn)行了比較，試驗(yàn)結(jié)果顯示山羊痘弱毒疫苗免疫后7～8d可檢測出抗體，皮內(nèi)、皮下注射接種方式的免疫效果優(yōu)于肌肉注射。制定了對山羊痘病在貴州省的防疫工作具有一定的指導(dǎo)意義的免疫程序：使用B組疫苗，采用皮內(nèi)注射方式對山羊進(jìn)行免疫，產(chǎn)生抗體的時(shí)間較快，水平較高，維持時(shí)間可達(dá)196d以上。 3.對山羊痘病變及山羊痘病毒進(jìn)行了比較詳細(xì)的透

4、射電鏡觀察。在感染的皮膚和肺上皮細(xì)胞的胞漿內(nèi)發(fā)現(xiàn)有大量不同成熟階段的典型的山羊痘病毒顆粒。病毒顆粒也可見于巨噬細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞的胞漿內(nèi)，甚至少量在血管腔內(nèi)。有髓神經(jīng)纖維也被病毒和被感染的巨噬細(xì)胞所波及。在山羊痘痘疹材料感染的雞胚絨毛尿囊膜痘斑的上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞以及感染的Vero-E6細(xì)胞中也可見成熟和不成熟的病毒顆粒。 4.建立了山羊痘的PCR檢測方法。用特異性引物擴(kuò)增出山羊痘弱毒疫苗和皮膚痘疹病毒P32基因，