山羊痘病毒表達載體的構(gòu)建.pdf

1、羊痘是由羊痘病毒(CPV)感染山羊、綿羊或牛等偶蹄動物引起的一種烈性傳染病,病畜以發(fā)熱、全身起痘為典型特征。本病世界范圍分布,是目前最嚴(yán)重的動物痘病毒病。羊痘病毒基因組較大,有表達多個外來基因的潛力,自然條件下只感染牛羊等反芻類動物,而對人和其它哺乳動物無傳染性,是牛、羊等重大傳染病重組活疫苗的理想載體。我國目前使用的山羊痘雞胚化弱毒疫苗的實踐證明有很好的免疫保護效果,以此構(gòu)建山羊痘活疫苗載體具有良好的前景。 本研究的目的是以我

2、國廣泛使用的山羊痘弱毒(GTPV)疫苗株G14-STV44-55為模板,通過基因重組等方法構(gòu)建新型的山羊痘病毒表達載體。本研究選擇CPV的三個可能的復(fù)制非必需區(qū),以VV I1L或VV P11為調(diào)控外源基因的啟動子,以GPT為報告基因,構(gòu)建CPV轉(zhuǎn)移載體,并與親本病毒G14-STV44-55株重組,篩選重組的GTPV突變株。將用于重組病毒篩選的VV 7.5K啟動子調(diào)控的gpt基因從PLSEG質(zhì)粒上切下,并克隆測序鑒定其正確后作為報告基因,

3、選用兩種痘苗病毒啟動子VV I1L和VV P11,用OVERLAPE PCR的方法與報告基因GPT上7.5K啟動子方向相背的連接起來,形成啟動子GPT復(fù)合DNA片段,構(gòu)成表達載體的調(diào)控和指示系統(tǒng),再克隆到PGM-T載體中測序鑒定其正確性。 本研究查閱相關(guān)文獻,從中選取CPV可能的三個復(fù)制非必需區(qū)：胸苷激酶(TK)基因,γ干擾素受體(γ-IFNR)基因和核糖核酸還原酶(RR)基因。根據(jù)基因BANK公布的羊痘病毒基因組序列設(shè)計引物,

4、使非必需區(qū)兩側(cè)各有800-1000bp側(cè)翼序列。以我國GTPV疫苗株G14-STV44-55為模板PCR擴增目的基因及其側(cè)翼序列,并克隆到PGM-T載體中測序,然后將已經(jīng)構(gòu)建的啟動子一報告基因復(fù)合DNA片段分別插入非必需區(qū)的Acc65 I,Pme I和BglII中,得到6個分別以TK基因,IFNR基因和RRASE基因為側(cè)翼、以痘苗病毒VV I1L和VV P11為調(diào)控外源基因的啟動子、以VV7.5K啟動子調(diào)控的GPT為報告基因的表達載體:

5、PGM-TK-I1L-GPT,PGM-TK-P11-GPT,PGM-IFNR-P11-GPT,PGM-IFNR-I1L-GPT,PGM-RR-I1L-GPT,PGM-RR-P11-GPT。采取3-5月齡的臨床健康的綿羊睪丸,用胰酶消化法培養(yǎng)睪丸原代細胞。將構(gòu)建的六種轉(zhuǎn)移載體分別利用脂質(zhì)體Liposome2000轉(zhuǎn)染GTPV疫苗株G14-STV44-55感染的綿羊睪丸細胞,37℃5％CO2培養(yǎng)至出現(xiàn)CPE,收獲病毒,并以霉酚酸,氨基喋呤為