表達(dá)小反芻獸疫病毒H、F蛋白的重組山羊痘病毒的構(gòu)建及免疫原性研究.pdf

1、小反芻獸疫（Peste des petits of ruminants，PPR）是由小反芻獸疫病毒（Pestedes petits of ruminants virus，PPRV）引起的危害山羊、綿羊等小反芻動(dòng)物的重大疫病，為世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（The World Organisation for Animal Health）發(fā)布的A類烈性傳染病之一。近年來，PPR在我國(guó)周邊國(guó)家和地區(qū)及我國(guó)西藏自治區(qū)的肆虐對(duì)我國(guó)的養(yǎng)羊業(yè)構(gòu)成嚴(yán)重的威脅。<

2、br>　　 目前，我國(guó)西藏和新疆等西部地區(qū)采用經(jīng)Vero細(xì)胞傳代弱化的PPRV弱毒疫苗來預(yù)防PPR。但是，弱毒疫苗免疫小反芻獸之后無法與野毒感染相區(qū)別，不利于對(duì)PPR_的血清學(xué)監(jiān)控，更重要的是，PPRV弱毒疫苗熱敏感性強(qiáng)，限制了其在熱帶地區(qū)的應(yīng)用。由于山羊痘（Goat pox，GP）與PPR宿主范圍一致，地理分布區(qū)域類似，GPV弱毒疫苗具有較強(qiáng)的熱穩(wěn)定性，并且隨著DNA重組技術(shù)的發(fā)展，山羊痘病毒（Goat pox virus，GPV）

3、在做為疫苗載體方面顯示出很強(qiáng)的優(yōu)越性，國(guó)外已有將PPRV保護(hù)性抗原基因F/H插入山羊痘病毒疫苗載體構(gòu)建二重疫苗進(jìn)行免疫學(xué)研究的報(bào)道，并且顯示了良好的應(yīng)用前景，但在國(guó)內(nèi)尚未見相關(guān)的報(bào)道。本研究將利用我國(guó)自行培育并得到廣泛應(yīng)用的GPV弱毒株，分別構(gòu)建表達(dá)PPRV囊膜蛋白F和H的重組山羊痘病毒，并對(duì)其免疫原性進(jìn)行了初步評(píng)估。
　　 試驗(yàn)一、小反芻獸疫重組山羊痘病毒的構(gòu)建。首先在已有載體pTK-gpt-gfp的基礎(chǔ)上，構(gòu)建了痘病毒晚期啟

4、動(dòng)子p11驅(qū)動(dòng)的、內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)（ires）介導(dǎo)的黃嘌呤鳥嘌呤磷酸轉(zhuǎn)移酶基因（gpt）和綠熒光蛋白基因（egfp）串聯(lián)表達(dá)的轉(zhuǎn)移載體pTK-gpt-ires-egfp，將PPRV保護(hù)性抗原H、F基因片段分別克隆至pTK-gpt-ires-egfp，SalⅠ位點(diǎn)，獲得載體質(zhì)粒pTK-gig-PPRV-H、pTK-gig-PPRV-F；以我國(guó)自行培養(yǎng)并得到廣泛應(yīng)用的山羊痘病毒（GPV）疫苗株為親本病毒，以山羊痘病毒（GPV）的復(fù)制非必需

5、區(qū)TK基因?yàn)榘悬c(diǎn)，通過質(zhì)粒pTK-gig-PPRV-H、pTK-gig-PPRV-F與GPV的同源重組，霉酚酸（Mycophenolic acid，MPA）藥物篩選，病毒蝕斑單克隆化后獲得完全純化的重組病毒rGPV-PPRV-F和rGPV-PPRV-H。以F、H基因的特異性引物PCR鑒定，表明基因片段分別在重組病毒中正確整合；經(jīng)Western-blot和IFA（間接免疫熒光）方法證實(shí)H蛋白、F蛋白分別在重組病毒中穩(wěn)定表達(dá)。
　　

6、 試驗(yàn)二、rGPV-PPRV-F、rGPV-PPRV-H重組病毒的初步免疫研究。以2×10。PFU的rGPV-PPRV-F、rGPV-PPRV-H皮內(nèi)注射免疫山羊，一免后第28天進(jìn)行加強(qiáng)免疫，采血分離血清進(jìn)行病毒中和試驗(yàn)。結(jié)果表明，本研究構(gòu)建的小反芻獸疫重組山羊痘病毒rGPV-PPRV-H、rGPV-PPRV-F一次免疫山羊，3周后PPRV中和抗體轉(zhuǎn)陽(yáng)率可達(dá)100％（6/6）、100％（3/3），二免后PPRV中和抗體效價(jià)進(jìn)一步得到增強(qiáng)