Asia-1型犬瘟熱病毒分離株H蛋白免疫原性分析及重組犬腺病毒2型的構(gòu)建.pdf

1、犬瘟熱 (Canine distemper，CD)是由犬瘟熱病毒 (Canine distemper virus，CDV)感染引起的犬及其他肉食動(dòng)物的一種急性或亞急性、高度接觸性傳染性疾病，是我國(guó)當(dāng)前對(duì)養(yǎng)犬業(yè)、毛皮動(dòng)物養(yǎng)殖業(yè)和野生動(dòng)物保護(hù)業(yè)危害最大的疫病之一。常規(guī)弱毒疫苗雖然在CD防控中發(fā)揮了非常重要的作用，但是也存在諸多缺點(diǎn)。加之犬瘟熱病毒對(duì)流行因素的逐漸適應(yīng)以及大量變異株的出現(xiàn)，全球范圍內(nèi)，犬瘟熱的感染呈上升趨勢(shì)，且其中有很多是免疫

2、群體爆發(fā)犬瘟熱的報(bào)道。因此，有必要尋求更加安全、有效的影響新型疫苗。
　　 本研究首先對(duì)Asia-1 型犬瘟熱病毒分離株 (HLJ2-07株) 優(yōu)勢(shì)保護(hù)性抗原基因－H蛋白基因進(jìn)行了序列測(cè)定、遺傳進(jìn)化分析、真核表達(dá)和重組質(zhì)粒DNA的小鼠免疫試驗(yàn)，初步驗(yàn)證其免疫原性。并在此基礎(chǔ)上把H基因定向克隆入本實(shí)驗(yàn)室已構(gòu)建完成的通用轉(zhuǎn)移載體pUC-△E3-EGFP中，構(gòu)建了含有犬瘟熱病毒H基因的轉(zhuǎn)移載體pUC-2△E3-H。對(duì)實(shí)驗(yàn)室已構(gòu)建的表達(dá)

3、綠色熒光蛋白的重組犬腺病毒2型rCAV-△E3-EGFP進(jìn)行了蝕斑篩選、純化和PCR鑒定，對(duì)純化完全的病毒進(jìn)一步進(jìn)行了生物學(xué)特性分析（形態(tài)學(xué)鑒定、重組病毒與親本毒株的病毒滴度比較、生長(zhǎng)特性分析、遺傳穩(wěn)定性分析）。最后以轉(zhuǎn)移載體pUC-2△E3-H轉(zhuǎn)染rCAV-△E3-EGFP感染的COS-7細(xì)胞，經(jīng)體內(nèi)同源重組，獲得了表達(dá)犬瘟熱病毒 H蛋白的重組犬腺病毒2型rCAV-2△E3-H。
　　 序列測(cè)定結(jié)果顯示：H基因全長(zhǎng)1824 b

4、p，編碼607個(gè)氨基酸，含有9個(gè)潛在的N-聯(lián)糖基化位點(diǎn)和12個(gè)半胱氨酸殘基。同源性分析表明：CDV HLJ2-07株與Onderstepoort、Convac 疫苗株親緣關(guān)系最遠(yuǎn)，核苷酸同源性僅為91.4％和91.3％；系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示：HLJ2-07株屬Asia-1型；與32株中國(guó)分離株比對(duì)，顯示目前國(guó)內(nèi)大部分分離株屬于Asia-1型。由此，一方面說明，基因型的改變可能是H蛋白抗原性變化的一個(gè)重要原因。另一方面，顯示出從國(guó)內(nèi)主要流行株

5、中選取合適毒株，構(gòu)建疫苗的必要性和必需性。H蛋白的真核表達(dá)及免疫原性分析結(jié)果顯示：pcDNA3.1-H免疫組血清可與感染已知HLJ2-07株病毒的MDCK-SLAM細(xì)胞發(fā)生特異性IPMA反應(yīng)，染色后使細(xì)胞呈現(xiàn)陽性的棕紅色，證明免疫動(dòng)物后可產(chǎn)生抗CDV抗體；ELISA血清抗體滴度可達(dá)1：28～1：79；病毒中和抗體可達(dá)1：11～1:32，表明H蛋白具有免疫原性。重組病毒rCAV-△E3-EGFP的感染MDCK細(xì)胞后，待出現(xiàn)90％以上細(xì)胞病

6、變時(shí)收獲病毒，經(jīng)數(shù)次蝕斑篩選和純化，PCR鑒定，最終達(dá)到純化完全，生物學(xué)特性研究顯示，EGFP基因的插入和E3區(qū)的缺失不影響重組病毒的增殖特性，其毒力、生長(zhǎng)特性與親代病毒CAV-2相似，保持原有疫苗株的生長(zhǎng)特性，且在MDCK細(xì)胞上連續(xù)傳代25代遺傳性狀穩(wěn)定，顯示出一定得應(yīng)用前景。基于重組病毒rCAV-△E3-EGFP，我們經(jīng)構(gòu)建好的轉(zhuǎn)移載體pUC-2△E3-H經(jīng)純化后用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染感染了rCAV-△E3-EGFP的COS-7細(xì)胞，病變明