豬細小病毒1型VP2蛋白與豬圓環(huán)病毒2型Cap蛋白共表達產(chǎn)物免疫原性鑒定.pdf

1、豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)是臨床中誘發(fā)斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(PMWS)的主要病原，常與豬細小病毒1型(PPV1)發(fā)生混合感染而導致更為嚴重的PMWS臨床癥狀和組織病理損傷，給世界養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟損失。近年來，國內關于PCV2與PPV1混合感染的報道較多，引起了廣泛關注。通過對臨床中PPV1、新型豬細小病毒(PPV2、PPV3、PPV4)與PCV2的混合感染情況進行了流行病學調查，對其流行毒株進行了遺傳變異分析，為我國PPVs和

2、PCV2的綜合防治提供科學依據(jù)。鑒于我國豬群中二者存在混合感染現(xiàn)象，因而開發(fā)針對PCV2和PPV1的二聯(lián)亞單位疫苗具有重要的臨床應用價值。PCV2-Cap蛋白和PPV1-VP2蛋白分別是PCV2和PPV1的主要結構蛋白，在誘導機體特異性免疫反應中發(fā)揮重要作用，是亞單位疫苗制備的重要候選抗原。本研究以桿狀病毒系統(tǒng)表達PPV1-VP2蛋白制備單克隆抗體，為亞單位疫苗制備中VP2蛋白的表達提供檢測手段;采用桿狀病毒雙表達系統(tǒng)共表達PPV1-V

3、P2蛋白與PCV2-Cap蛋白，經(jīng)動物免疫試驗鑒定其免疫原性，為亞單位疫苗的研制提供了技術支撐。
　　為了解新型豬細小病毒(PPV2、PPV3和PPV4)與PMWS發(fā)生之間的關系，本研究對疑似PCVAD病料進行了PPV1、PPV2、PPV3、PPV4與PCV2的混合感染調查及分子流行病學分析，為PMWS的致病機理的研究提供新的思路。流行病學調查表明，PPVs與PCV2單獨感染陽性檢測率分別為:5.56％(PPV1)、39.56％(

4、PPV2)、45.11％(PPV3)、21.56％(PPV4)和47.33％(PCV2);PPVs與PCV2的混合感染陽性檢測率分別為:4％(PPV1+PCV2)、22.44％(PPV2+PCV2)、24％(PPV3+PCV2)和12％(PPV4+PCV2)。選取其中PPVs和PCV2陽性樣品對病毒主要結構蛋白編碼基因進行了遺傳進化分析與氨基酸序列比對。結果表明，PPVs與PCV2在遺傳進化上主要形成2大分支;通過氨基酸序列比對分析找到

5、了一些可能影響PPVs與PCV2遺傳進化的關鍵氨基酸位點。鑒于新型PPVs與PCV2混合感染情況較為嚴重，因而推測二者在PMWS的發(fā)生中起到了相互促進作用，這為PMWS疾病模型的研究提供一定線索。
　　為了建立PPV1抗原檢測方法，以重組桿狀病毒表達PPV1-VP2蛋白免疫BALB/c小鼠，融合后采用IPMA方法篩選獲得了8株針對PPV1-VP2蛋白的單克隆抗體。結果表明，所制備的單抗均可與PPV1感染的ST細胞呈陽性反應且可以與

6、自然PPV1-VP2蛋白產(chǎn)生良好的免疫反應。為了鑒定這些單抗所針對的抗原表位，我們將PPV1-VP2蛋白依次進行了分段截短表達與兩端截短表達，并通過間接ELISA的方法來掃描多肽與單抗的反應特性，從而確定單抗表位的最短核心序列。結果表明，這8株單抗總共針對3個VP2表位，分別為B5-E1(228QQITDA233)、B10-E2(284RSLGLPpK291)與B15-E3(344FEYSNGGPFLTPI356)。PPV1-VP2氨基

7、酸序列比對結果表明，B10-E2與B15-E3在29條比對序列中完全保守，而B5-E1在233位氨基酸發(fā)生堿基替換。以其中1株單抗(8E4)作為檢測抗體，通過間接ELISA方法，對重組桿狀病毒表達的PPV1-VP2蛋白產(chǎn)物進行的動力學檢測表明，重組桿狀病毒感染后72 h蛋白表達量最高:利用單抗8E4對PPV1感染細胞規(guī)律的測定結果顯示，接種后16h可以檢測到病毒感染的陽性細胞;以8E4為檢測抗體對PPV1-VP2蛋白的亞細胞定位進行觀察

8、，結果顯示，感染后24 h病毒顆粒組裝完成并進入細胞質。本研究成功制備了針對PPV1-VP2蛋白的單克隆抗體，鑒定了其表位核心序列，并建立了針對VP2蛋白抗原及病毒繁殖規(guī)律的檢測方法，為亞單位疫苗的研制及PPV1感染機制的研究奠定了基礎。
　　為了驗證共表達PPV1-VP2與PCV2-Cap蛋白的免疫原性，以桿狀病毒表達系統(tǒng)共表達PPV1-VP2和PCV2-Cap蛋白并以各自的單表達產(chǎn)物作為對照。SDS-PAGE和Western

9、blot鑒定結果顯示，PPV1-VP2蛋白與PCV2-Cap蛋白均得到表達，且與PPV1和PCV2的抗體產(chǎn)生良好的免疫反應。用共表達PPV1-VP2與PCV2-Cap蛋白及及各自單表達蛋白制備4種亞單位疫苗:PPV1-VP2/PCV2-Cap共表達疫苗組、PCV2-Cap+PPV1-VP2單苗混合組、PPV1-VP2單苗組、PCV2-Cap單苗組，經(jīng)肌肉注射途徑分別免疫BALB/c小鼠和豚鼠測定免疫動物血清抗體鑒定它們的免疫原性，同設商

10、品化PCV2滅活苗和PPV1滅活苗陽性對照組及PBS陰性對照組。對4種亞單位疫苗免疫小鼠血清抗體測定結果顯示，PPV1抗體效價平均值均可達到1∶3200;PCV2抗體效價分別為1∶3200、1∶12800與1∶12800。豚鼠免疫試驗血清中PPV1抗體效價平均值分別為1∶1600、1∶800與1∶800; PCV2特異性抗體效價平均值分別為1∶3200、1∶6400與1∶6400。本研究證實共表達PPV1-VP2/PCV2-Cap疫苗免