豬細(xì)小病毒VP2蛋白基因重組腺病毒的構(gòu)建與免疫特性研究.pdf

1、豬細(xì)小病毒病是由豬細(xì)小病毒(PPV)感染引起的以母豬繁殖障礙為主要特征的病毒性傳染病?，F(xiàn)已成為豬的一種世界性疾病，給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。在PPV的結(jié)構(gòu)蛋白中，VP2蛋白是能在動(dòng)物體內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體的主要結(jié)構(gòu)蛋白。因此，VP2蛋白基因是研究PPV基因工程疫苗的主要目的基因。本研究的目的是把VP2基因克隆入腺病毒表達(dá)載體系統(tǒng)中，構(gòu)建成重組腺病毒使VP2蛋白基因在重組腺病毒中獲得表達(dá)，并在仔豬體內(nèi)進(jìn)行免疫特性研究，為研究PPV重組腺病

2、毒疫苗奠定基礎(chǔ)。 1.根據(jù)GenBank中的PPV基因序列(NC001718)設(shè)計(jì)一對引物，用PCR技術(shù)從國內(nèi)分離的PPV弱毒株NADL-2中獲得大小為1816bp包含VP2蛋白基因全長的PCR產(chǎn)物，經(jīng)純化后與穿梭載體pShuttle-CMV連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α，將鑒定正確的重組質(zhì)粒pShuttle-CMV-VP2線性化后與骨架載體pAdEasy-1經(jīng)電轉(zhuǎn)化在大腸桿菌菌株BJ5183中進(jìn)行同源重組。在具有卡那霉素的LB平板

3、上篩選陽性菌落，然后用Pac I酶對重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，結(jié)果與預(yù)計(jì)的相符，陽性重組質(zhì)粒命名為rAd-vp2。鑒定的重組質(zhì)粒rAd-vp2大量提取，Pac I酶切線性化，陽離子脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染到HEK293A細(xì)胞，于37℃培養(yǎng)6天后出現(xiàn)細(xì)胞病變，收獲病毒。經(jīng)噬斑純化，用RT-PCR、間接免疫熒光試驗(yàn)(IFA)Western-blotting和電鏡觀察鑒定VP2基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，結(jié)果表明重組腺病毒中的VP2蛋白基因能夠在HBK293A細(xì)胞中轉(zhuǎn)

4、錄和表達(dá)，將重組病毒在293細(xì)胞上連續(xù)傳代至10代，測定病毒滴度，其TCID50均可達(dá)10-12/mL。 2.利用PCR技術(shù)，擴(kuò)增VP2基因的一段7.74bp的DNA片段，克隆到pMD18-TVector后，再定向克隆到表達(dá)載體pET-32a中并轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，用IPTG誘導(dǎo)后進(jìn)行SDS-PAGE、Western-blotting分析。結(jié)果顯示，結(jié)構(gòu)蛋白VP2基因可在大腸桿菌BL21中高效表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物的分子量約為45kD

5、，并能被細(xì)小病毒陽性血清所識別，表達(dá)蛋白以包涵體形式存在.表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)His-Bind蛋白純化試劑盒純化后包被酶標(biāo)板，初步建立了檢測PPV抗體的ELISA方法。 3.將重組腺病毒免疫30日齡的斷奶仔豬，同時(shí)設(shè)定疫苗和空白對照組。采用肌肉注射途徑，分別在免疫前和免疫后第7d、14d、21d、28d、35d、42d、56d經(jīng)前腔靜脈采血，制備血清。用間接ELISA和血凝抑制試驗(yàn)檢測樣品中的PPV特異性抗體。結(jié)果顯示，免疫后7d，抗體水