犬細(xì)小病毒VP2基因的克隆、表達(dá)及在診斷應(yīng)用上的研究.pdf

1、犬細(xì)小病毒病(Canine Parvovirus disease)是由犬細(xì)小病毒(Canine parvovirus,CPV)引起犬的一種急性傳染病.本病在世界各地均有發(fā)生,各種年齡、品種的犬易感,尤其是斷奶后幼犬的發(fā)病率和死亡率均很高.隨著養(yǎng)犬業(yè)的發(fā)展,對(duì)犬病的防控日趨重要.因此,制定積極有效的預(yù)防措施,獲得及時(shí)準(zhǔn)確的診斷信息至關(guān)重要. 本試驗(yàn)通過(guò)設(shè)計(jì)合成特異性引物,擴(kuò)增CPV VP2基因并進(jìn)行了原核表達(dá),純化后獲得VP2重組蛋白,以

2、其為包被抗原建立敏感、特異、檢出率高的間接ELISA方法:同時(shí)用此方法對(duì)抗CPV特異性單抗進(jìn)行篩選,以獲得了抗CPV VP2特異性單抗. 根據(jù)GenBank公布的CPV VP2基因序列,設(shè)計(jì)并合成一對(duì)特異性引物,以CPV-YM株為模板經(jīng)經(jīng)PCR擴(kuò)增出VP2基因片斷,將其克隆到pMD18-T載體中.經(jīng)過(guò)測(cè)序后,將VP2基因亞克隆至原核表達(dá)載體pET-30a上,然后轉(zhuǎn)入表達(dá)宿主菌Rosetta中,表達(dá)了目的蛋白,表達(dá)量為29﹪,分子

3、量約為67ku.通過(guò)Western blot證明該重組蛋白具有抗原性.VP2重組蛋白經(jīng)鎳離子親和樹脂純化,純度達(dá)到0.7mg/mL. 用VP2重組蛋白作為包被抗原,確定了最佳優(yōu)化條件和結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn).通過(guò)特異性試驗(yàn)證明包被的抗原僅與CPV標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清發(fā)生反應(yīng),不與犬瘟熱、犬腺病毒、犬副粘病毒、波特氏桿菌等疫病的標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清發(fā)生交叉反應(yīng):與進(jìn)口CPV ELISA試劑盒進(jìn)行比對(duì),對(duì)血清樣品92份的檢測(cè)結(jié)果表明符合率為97.8﹪;對(duì)相同

4、的血清樣品48份進(jìn)行了4次重復(fù)試驗(yàn)變異系數(shù)小于16﹪.因此本試驗(yàn)成功的建立了檢測(cè)CPV血清抗體的間接ELISA方法.應(yīng)用該方法對(duì)國(guó)內(nèi)部分地區(qū)采集的血清樣品227份進(jìn)行檢測(cè),其中164份為陽(yáng)性,陽(yáng)性率為72.25﹪. 以純化的CPV-z株免疫BAL,B/c小鼠,應(yīng)用雜交瘤技術(shù),采用已建立的間接EIJSA方法篩選獲得了能穩(wěn)定分泌特異性單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞系3株,分別命名為E4F1lF7.E389C4,F10G10AlO.亞類鑒定結(jié)