犬瘟熱病毒N蛋白單克隆抗體的制備和特性研究及犬細(xì)小病毒VP2基因變異分析.pdf

1、犬瘟熱(Canine Distemper, CD)是由副黏病毒科麻疹病毒屬的犬瘟熱病毒(Canine distempervirus，CDV)引起的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病。犬細(xì)小病毒性腸炎是由犬細(xì)小病毒(Canine Parvovirus，CPV)引起的以腸炎、腹瀉與主的烈性傳染病。為了更好的控制與預(yù)防上述兩種疫病的流行，本研究開展了犬瘟熱病毒N蛋白單克隆抗體的制備和特性研究及犬細(xì)小病毒VP2基因變異分析。
　　首先，本研

2、究以CDV3的RNA為模板，原核表達(dá)純化了帶His標(biāo)簽的N蛋白截短片段(aa277-471)，免疫BALB/c雌鼠后，將其B淋巴細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞融合，通過包被N蛋白截短片段(aa277-471)的ELISA篩選，獲得分泌抗CDV的單克隆抗體雜交瘤陽性細(xì)胞1株，命名為1N8，亞類鑒定為IgG1a，kappa鏈，該單克隆抗體間接免疫熒光檢測陽性、WB檢測陽性。
　　接下來采用噬菌體展示和肽掃描的方法，篩選1N8結(jié)合的抗原表位

3、:合成N蛋白(aa277-471)的15肽文庫，每條多肽長度15aa，位移5aa，通過結(jié)合和篩選，得到一條與單克隆抗體1N8陽性反應(yīng)的多肽，通過多肽N端和C端的不斷縮減，最終證明該抗原表位的最小識別單位:351NFGRSYFDp359。通過3D模擬，發(fā)現(xiàn)此表位位于N蛋白的外側(cè)，其與CDV陽性血清具備一定的ELISA反應(yīng)能力。通過比對，其與CDV同屬麻疹病毒、牛瘟病毒，小反芻獸疫病毒一致，并對小反芻獸疫病毒進(jìn)行了WB驗(yàn)證，其結(jié)果為陽性。<

4、br>　　以雜交瘤細(xì)胞1N8為模板，分離出抗體輕鏈和重鏈可變區(qū)，通過基因工程的方式組裝成單鏈抗體，通過原核表達(dá)，獲得了重組1N8單鏈抗體蛋白，經(jīng)過間接ELISA和競爭ELISA方法檢測，其具備1N8單抗的部分活性。
　　以腺病毒為表達(dá)載體，研究了351NFGRSYFDp359表位疫苗的免疫效力:構(gòu)建含351NFGRSYFDp359表位和腸炎細(xì)小病毒VP2基因的表達(dá)盒，通過PCR和WB檢測，重組腺病毒在核酸和蛋白水平上均能表達(dá)出外源

5、片段。小鼠免疫試驗(yàn)顯示:與商品化對照疫苗相比，重組腺病毒的CPV的ELISA效價與之相當(dāng)，但CDV的ELISA效價比較低。
　　最后，在本研究開展了CPV VP2基因遺傳變異研究:歷經(jīng)4年，收集到我國主要城市的犬細(xì)小病毒陽性樣品37份，分離病毒8株，獲得犬細(xì)小病的陽性樣品VP2基因序列22份，其中CPV-2a型20份，CPV-2b型2份，測序結(jié)果顯示我國CPV存在CPV-2a(Ser297Ala)變異，而且CPV VP2基因序列相