犬瘟熱病毒和犬細(xì)小病毒高免卵黃抗體的制備及其殼聚糖微球的研究.pdf

1、犬瘟熱病毒（Canine distemper virus，CDV）和犬細(xì)小病毒（Canine parvovirus virus，CPV）均能引起的犬的高度接觸性、致死性傳染病，是世界各地常見的犬只病毒性疾病常引起巨大損失.犬瘟熱常表現(xiàn)為呼吸系統(tǒng)、消化系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)癥狀。犬細(xì)小病毒病常表現(xiàn)為出血性腸炎，在幼犬易引發(fā)心肌炎。臨床上常用特異性的高免血清和單克隆抗體對犬瘟熱和犬細(xì)小病毒病進行防治。利用特定抗原多次免疫后的蛋雞可產(chǎn)生相應(yīng)的特異性高

2、免卵黃抗體（Eggyolk immunoglobulin，IgY），其較高免血清和單克隆抗體有成本低、技術(shù)簡便、可大量生產(chǎn)等特點。
　　 試驗1將市售的英特成CDV、CPV二聯(lián)弱毒苗分別接毒于非洲綠猴腎細(xì)胞（Vero細(xì)胞）、貓腎細(xì)胞（F81細(xì)胞）。Vero細(xì)胞采用同步和異步接種CDV的方法進行比較，選擇不同血清濃度的F81細(xì)胞生長液同步接種CPV，試驗結(jié)果為Vero細(xì)胞采用異步接種可獲得較多的CDV，F(xiàn)81細(xì)胞同步接種CPV時最

3、適宜的血清濃度為5％。并通過中和試驗、反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Reverse transcription-PCR，RT-PCR）、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase chain reaction，PCR）鑒定所增殖的病毒。
　　 試驗2制備CDV和CPV蜂膠佐劑滅活苗分別對25周齡以上蛋雞進行免疫，該試驗持續(xù)21天，第1、7、14天蛋雞產(chǎn)蛋后對其進行免疫，第4、7、10、14、17、21天收集雞蛋，采用聚乙二醇6000（Poly

4、ethylene glycol6000，PEG6000）二步沉淀法提取雞蛋中的CDV和CPV高免卵黃抗體。以濃縮后的病毒作為抗原，以未免疫的雞蛋的卵黃抗體為對照，進行間接酶聯(lián)免疫吸附（Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試驗，測定所得CDV、CPV高免卵黃抗體效價水平均為1:320。用固定病毒的中和試驗方法分別檢測市售CDV和CPV單克隆抗體效價分別約為1:64和1:128，而CDV和CPV高

5、免卵黃抗體效價均約為1:32。
　　 試驗3犬的胃酸pH值為1～2，而卵黃抗體在胃蛋白酶存在的條件下，pH值在2.0以下溫育1h后完全失去活性。本試驗將實驗室制備的CDV和CPV高免卵黃抗體，分別加入酸化0.25％殼聚糖溶液中。其中高免卵黃抗體與殼聚糖的質(zhì)量比為1:10，在超聲作用下以硫酸鈉為交聯(lián)劑，利用形成的殼聚糖微球?qū)Ω呙饴腰S抗體進行包封；其后分別以包封后的載藥殼聚糖微球的上清液和未包封的高免卵黃抗體液作為包被抗原，二者的E

6、LISA試驗結(jié)果差異顯著，殼上清液幾乎不顯色，殼聚糖微球?qū)Ω呙饴腰S抗體具有良好的包封效果，未被微球包封的卵黃抗體極少。該載藥微球在pH值為1的模擬胃液（Simulated gastric fluid，SGF）內(nèi)37℃搖床2h，期間模擬胃液的蛋白質(zhì)濃度持續(xù)下降，2h后該微球在顯微鏡下觀察仍保持其良好的包封形態(tài)，所制備的載藥殼聚糖微球能夠很好的保護卵黃抗體，未有大量微球破損并釋放出高免卵黃抗體，使口服高免卵黃抗體這一給藥途徑成為可能。目前國