檢測(cè)犬細(xì)小病毒抗原和抗體ELISA方法的建立和應(yīng)用.pdf

1、犬細(xì)小病毒病是具有高度接觸性的烈性傳染病，既嚴(yán)重威脅著家養(yǎng)寵物的身體健康，又是對(duì)當(dāng)前我國養(yǎng)犬業(yè)、毛皮動(dòng)物養(yǎng)殖業(yè)和野生動(dòng)物保護(hù)業(yè)危害較大的疫病。在犬細(xì)小病毒病診斷方法中，ELISA檢測(cè)方法方便快捷、費(fèi)用低廉，適于在基層推廣采用F81細(xì)胞大量擴(kuò)增犬細(xì)小病毒CPV-GN株，利用聚已二醇(PEG6000)濃縮后，測(cè)得其蛋白濃度的基礎(chǔ)上。采用倍比稀釋法獲得一系列的蛋白濃度值，同時(shí)將陽性血清也倍比稀釋，利用方陣滴定法進(jìn)行酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA

2、)檢測(cè)確定了抗原最佳的包被濃度為9μg/ml；陽性對(duì)照的血清稀釋度為1∶160。最適的封閉液為1.75％的明膠，封閉條件為37℃1h；待檢樣品與包被抗原的反應(yīng)時(shí)間為37℃2h：酶標(biāo)二抗的反應(yīng)時(shí)間為37℃1h。經(jīng)過一系列的驗(yàn)證試驗(yàn)，證明建立的間接ELISA方法具有較強(qiáng)的穩(wěn)定性和特異性。取50份免疫犬血清，用該方法與常規(guī)的HI試驗(yàn)分別進(jìn)行抗體檢測(cè)，兩者的共同符合率為94％。其中，明顯陽性和陰性的樣品，共同符合率能達(dá)到100％。說明建立的間接

3、ELISA方法具有簡(jiǎn)便、快速、特異的優(yōu)點(diǎn)。為了評(píng)估犬細(xì)小病毒的免疫情況，將建立的間接ELISA方法應(yīng)用于140份犬細(xì)小病毒血清抗體的檢測(cè)，而且一年后，對(duì)其中的60只犬再次采集血清進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果證明：現(xiàn)在采取的免疫程序，完全可以提供足夠的保護(hù)力抵制犬細(xì)小病毒的感染。而且疫苗的免疫效果與犬的性別和品種沒有太大的相關(guān)性，而犬的年齡在很大程度上影響著疫苗的免疫效果。 以純化的犬細(xì)小病毒(Canine parvovirus，CPV)CPV

4、-GN毒株為免疫原，接種6周齡的Balb/c小鼠。最后一次加強(qiáng)免疫后3天，取小鼠脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞(SP2/0)融合。以純化的CPV建立的間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)和中和試驗(yàn)(HT)篩選陽性克隆，并用有限稀釋法進(jìn)行亞克隆，用F81細(xì)胞包被板子進(jìn)行ELISA檢測(cè)，剔除與細(xì)胞蛋白交叉反應(yīng)的陽性克隆，共獲得3株CPV特異性雜交瘤細(xì)胞株A7、C5、E9。它們的中和效價(jià)分別為1；160、1；80和1；160。經(jīng)過一系列鑒定，這3株單抗株(

5、McAbS)均有很好的特異性和穩(wěn)定性。利用A7單抗株制備單抗的腹水，間接ELISA和血凝抑制試驗(yàn)(HI)檢測(cè)單抗腹水的效價(jià)分別為1∶1280和1∶640。 在已經(jīng)制備犬細(xì)小病毒單克隆抗體的基礎(chǔ)上，將單抗加以辣根過氧化物酶標(biāo)記，建立了雙抗夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)犬細(xì)小病毒的方法。結(jié)果表明：?jiǎn)慰拱坏淖罴褲舛葹?ug/ml；最適的封閉液為1.75％的明膠，封閉條件為37℃1h：待檢樣品與包被單抗的反應(yīng)時(shí)間為37℃2h

6、：酶標(biāo)單抗的反應(yīng)時(shí)間為37℃1h；檢測(cè)樣品直接用生理鹽水稀釋后，即可檢測(cè)。經(jīng)過一系列的驗(yàn)證試驗(yàn)，證明建立的夾心ELISA方法具有較強(qiáng)的穩(wěn)定性和特異性。將建立的夾心ELISA方法應(yīng)用于40份臨床樣品的檢測(cè)，并且與血凝試驗(yàn)相比較，兩者的共同符合率為92.5％。其中，明顯陽性和陰性的樣品，共同符合率能達(dá)到100％。對(duì)臨床收集的20份糞便樣品，利用建立的夾心ELISA方法進(jìn)行檢測(cè)，并且與PCR方法進(jìn)行比較，對(duì)于檢測(cè)結(jié)果不符合的樣品接種F81細(xì)胞