檢測犬狂犬病毒抗體的間接ELISA方法的建立.pdf

1、本文進行了如下研究： 1.犬IgG的分離純化和抗犬IgG單克隆抗體的制備 采用辛酸-硫酸銨鹽析和Hiload 16/60 superdex 200 prep pg凝膠柱層析法從犬血清中獲得IgG，經(jīng)SDS-PAGE電泳鑒定。用BCA法測定IgG濃度為2mg/ml。用純化后的犬IgG，采用常規(guī)免疫法免疫6-8周齡雌性BABL/c小鼠。取三次免疫后的小鼠脾細胞與SP2/0骨髓瘤細胞按10：1混合，用0.7ml 50％PEG

2、4000進行細胞融合，對雜交瘤細胞進行篩選，陽性孔經(jīng)3次有限稀釋法克隆，成功獲得6株可穩(wěn)定分泌單克隆抗體的雜交瘤細胞株，對6株McAb初步鑒定結(jié)果表明，其抗體類型均為IgG1，輕鏈都為κ鏈。腹水的間接ELISA效價介于1.3×104～6.6×106之間。Western-Blotting試驗證實有3株細胞為分泌針對犬IgG輕鏈抗體的雜交瘤細胞株，有3株細胞為分泌針對犬IgG重鏈抗體的雜交瘤細胞株。 2.狂犬病毒核蛋白單克隆抗體的制

3、備及特性鑒定 用純化的重組RV N蛋白免疫BALB/c小鼠，取其脾細胞與SP2/0骨髓瘤細胞融合，通過間接ELISA方法篩選雜交瘤細胞，陽性孔經(jīng)3次有限稀釋法克隆，成功獲得1A4、7H3、7H6、7F6及7F7 5株能穩(wěn)定傳代并分泌抗重組RV N蛋白單克隆抗體的雜交瘤細胞。各單克隆抗體腹水間接ELISA效價在104-106之間。5株單克隆抗體的亞類均為IgG1，輕鏈均為κ鏈。Western-blot分析表明，所獲得的5株單克隆抗

4、體與重組RV N蛋白均具有反應(yīng)性。間接免疫熒光染色顯示，7F6與7F7可識別病毒感染Vero細胞中的RV N蛋白。 3.抗狂犬病毒糖蛋白單克隆抗體的制備及特性鑒定 用純化的原核表達的RV G蛋白免疫6～8周齡的雌性BALB/c小鼠，經(jīng)過3次免疫后，取其脾細胞與SP2/0骨髓瘤細胞進行融合，通過間接ELISA方法篩選雜交瘤細胞，陽性孔經(jīng)3次有限稀釋法克隆，成功獲得1株(1D10)能穩(wěn)定傳代并分泌抗重組RV G蛋白單克隆抗體

5、的雜交瘤細胞。間接ELISA效價2.56×104。單克隆抗體的亞類均為IgG1，輕鏈均為1(鏈。間接免疫熒光染色顯示腹水IFA效價為1：400。 4.抗犬IgG單克隆抗體的純化及其酶標(biāo)記 復(fù)蘇穩(wěn)定分泌抗犬IgG單克隆抗體的雜交瘤細胞株3D4，按常規(guī)方法制各腹水。用辛酸～硫酸銨及Protein G兩步法純化，經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)鑒定，證明腹水經(jīng)辛酸-硫酸銨及Protein G純化后具有較高的純度，可用于

6、酶標(biāo)記。采用過碘酸鈉氧化法將犬IgG與辣根過氧化物酶連接，獲得酶標(biāo)鼠抗犬IgG，酶標(biāo)記率為52.16％，克分子比為1.6；通過Dot-ELISA檢測，發(fā)現(xiàn)HRP標(biāo)記的鼠抗犬IgG在1：3000倍稀釋時，可以與1024倍稀釋的犬抗RV陽性血清起反應(yīng)。 5.NP-ELISA抗體檢測方法的建立 以原核表達的狂犬病毒核蛋白為抗原，建立了檢測狂犬病毒抗體的間接ELISA方法。最佳反應(yīng)體系為：抗原包被液為0.05M pH8.5的Tr

7、is-HCl緩沖液，抗原包被濃度為2ug/ml；封閉液為0.5％BSA/PBST，血清及二抗稀釋液為含0.1％BSA的PBST緩沖液，待檢血清的最佳稀釋倍數(shù)為1：100，酶標(biāo)抗體的最佳稀釋倍數(shù)為1：2000；待檢血清和酶標(biāo)二抗孵育時間均為60min，底物反應(yīng)時間10min。重復(fù)性試驗、阻斷性等試驗表明，該方法重復(fù)性好、靈敏度高；與美國SYNBIOTICS試劑盒比較，本試劑盒的診斷敏感性為91.2％，特異性為90.7％，符合率為90.9％