偽狂犬病病毒gE基因主要抗原表位區(qū)的原核表達(dá)及間接ELISA檢測(cè)方法的初步建立.pdf

1、本研究以豬偽狂犬病病毒(PRV)四川分離SL株為材料，分子克隆gE基因全序列并進(jìn)行生物信息學(xué)分析，選擇gE基因主要抗原表位區(qū)片段進(jìn)行原核表達(dá)載體構(gòu)建、原核表達(dá)及間接ELISA檢測(cè)方法的初步建立。
　　 1.gE基因的分子克隆與生物信息學(xué)分析
　　 參照GenBank中登錄號(hào)為NC006151的gE基因序列，以四川分離的PRVSL株為材料，TA克隆到pMD19T-SimpleVector，構(gòu)建重組克隆質(zhì)粒pMD-gE，經(jīng)酶

2、切鑒定和序列測(cè)定，克隆出長(zhǎng)為1964bp的基因片段，其中包含1734bp的gE基因完整閱讀框，編碼578個(gè)氨基酸。將測(cè)序結(jié)果及推導(dǎo)的氨基酸序列與國(guó)內(nèi)外不同來(lái)源的10個(gè)毒株進(jìn)行生物學(xué)信息分析，核苷酸序列同源性在97.5％～100.0％之間，氨基酸同源性在94.8％～99.8％之間，不同PRV毒株間gE基因在核苷酸水平和氨基酸水平上是高度保守的。分析得知，gE基因密碼子中G、C出現(xiàn)頻率較高，分別占了40％和30％，出現(xiàn)頻率最高的四個(gè)密碼子為

3、GGG、GAC、CTG和CGC，且GC3s含量達(dá)96.89％，證明該基因?qū)τ贕、C具有明顯的偏愛(ài)性；二級(jí)結(jié)構(gòu)分析，主要以轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)卷曲為主；通過(guò)疏水性分析和跨膜區(qū)預(yù)測(cè)，gE蛋白包含兩個(gè)疏水區(qū)，第一個(gè)疏水區(qū)（3～25位氨基酸殘基處）為信號(hào)肽，第二個(gè)疏水區(qū)（429～452位氨基酸殘基處）跨膜一次，N端位于膜外側(cè)，C端位于膜內(nèi)側(cè)；抗原位點(diǎn)預(yù)測(cè)分析，gE基因的抗原表位大部分位于N端300個(gè)氨基酸內(nèi)。
　　 2.gE基因主要抗原表位區(qū)原核

4、表達(dá)載體構(gòu)建及活性檢測(cè)
　　 以pMD-gE重組質(zhì)粒為模板，設(shè)計(jì)一對(duì)引物，PCR擴(kuò)增出gE基因主要抗原表位區(qū)(mgE)（包含52-263氨基酸殘基片段），TA克隆到pMD19T-SimpleVector載體上，構(gòu)建克隆重組質(zhì)粒pMD-mgE，將陽(yáng)性克隆菌送公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與模板中對(duì)應(yīng)序列完全一致。用EcoRⅠ和SalⅠ限制性?xún)?nèi)切酶定向克隆到pET-32a(+)載體中，構(gòu)建重組原核表達(dá)質(zhì)粒pET-mgE，然后轉(zhuǎn)化高效表達(dá)菌E.c

5、oliRosettaTM(DE3)進(jìn)行表達(dá)研究。經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，SDS-PAGE電泳檢測(cè)顯示，在約42Ku處出現(xiàn)一條特異帶，Western-Blot檢測(cè)顯示表達(dá)的融合目的蛋白具有特異的反應(yīng)原性。
　　 3.gE基因表達(dá)蛋白的純化及其ELISA檢測(cè)方法的初步建立
　　 對(duì)誘導(dǎo)表達(dá)后以包涵體形式存在的mgE重組蛋白進(jìn)行純化，作為包被抗原，并對(duì)抗原的包被，作用時(shí)間及底物選擇等條件進(jìn)行優(yōu)化，最后通過(guò)特異性試驗(yàn)、重復(fù)性試驗(yàn)、阻斷試

6、驗(yàn)以及和與標(biāo)準(zhǔn)試劑盒對(duì)比等方法檢驗(yàn)已建立的ELISA方法效果，初步建立了豬偽狂犬病病毒抗體的gE-ELISA檢測(cè)方法。結(jié)果表明，ELISA最佳工作條件為：重組抗原最適包被質(zhì)量濃度為8.3ug/mL，最適包被條件為4℃過(guò)夜，血清稀釋度為1:40，血清和酶標(biāo)二抗的反應(yīng)時(shí)間分別為37℃下90min和60min，反應(yīng)底物用TMB溶液，37℃顯色10min；統(tǒng)計(jì)學(xué)分析后確定陰陽(yáng)性的臨界值為0.32。各項(xiàng)檢測(cè)試驗(yàn)的結(jié)果表明此方法特異性強(qiáng)、重復(fù)性好、