鴨圓環(huán)病毒衣殼蛋白的原核表達(dá)及其間接ELISA檢測(cè)方法的建立.pdf

1、根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室提交的鴨圓環(huán)病毒(DuCV) GH01株基因序列信息，設(shè)計(jì)針對(duì)DuCVCapsid（Cap）基因的特異性引物，以實(shí)驗(yàn)室保存病料為模板，對(duì)DuCV GH01株Cap基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并且開(kāi)展了:DuCV GH01株Cap基因特征分析、截?cái)郈ap基因進(jìn)行原核表達(dá)，并對(duì)重組表達(dá)蛋白進(jìn)行親和層析純化，以Cap蛋白作為包被抗原，建立了檢測(cè)DuCV抗血清的間接ELISA方法，結(jié)果如下:
　　1.DuCV Cap基因的克隆及分子特

2、征分析利用PCR方法對(duì)DuCV GH01株Cap基因全長(zhǎng)進(jìn)行擴(kuò)增，構(gòu)建Cap基因的T克隆重組質(zhì)粒并進(jìn)行酶切鑒定，測(cè)序正確后對(duì)Cap基因及其編碼Cap蛋白進(jìn)行特征分析。結(jié)果表明:通過(guò)PCR擴(kuò)增獲得DuCV完整Cap基因，并成功構(gòu)建T克隆質(zhì)粒（pMD18-cap），測(cè)序分析表明，Cap基因全長(zhǎng)大小為774bp，編碼蛋白為257aa，分子量為29.7kDa，等電點(diǎn)(PI)為10.79;編碼的Cap蛋白有一個(gè)保守結(jié)構(gòu)域，屬于Circovirus

3、_capsid家族;含有3個(gè)糖基化位點(diǎn)，21個(gè)磷酸化位點(diǎn)，5個(gè)可能的抗原表位，分別位于1～39、60～85、96～116、129～180、211～243等區(qū)域;無(wú)信號(hào)肽、跨膜區(qū);二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)其無(wú)規(guī)則卷曲較多，三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)顯示其同源建模只有一個(gè)合適模型，為豬圓環(huán)病毒Cap蛋白。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析表明，鴨圓環(huán)病毒GH01株與番鴨FJFQ315株親緣關(guān)系最近，與鵝圓環(huán)病毒及天鵝圓環(huán)病毒親緣關(guān)系較近，與雞傳染性貧血病毒關(guān)系較遠(yuǎn)。Cap基因密碼子使用

4、分析顯示，存在密碼子偏嗜性，其中GGG、CAA、AAG、TTA與TCA使用頻率為零;亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，DuCV Cap蛋白主要定位于細(xì)胞核區(qū)域。
　　2.DuCV截?cái)郈ap基因的克隆、原核表達(dá)及蛋白純化根據(jù)實(shí)驗(yàn)室提交的DuCV GH01株完整Cap基因序列設(shè)計(jì)了針對(duì)截去核定位信號(hào)的截?cái)郈ap基因引物序列，以實(shí)驗(yàn)室保存病料為模板，對(duì)截?cái)郈ap基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并將擴(kuò)增的截?cái)郈ap基因克隆到pMD18-T載體上，經(jīng)雙酶切和測(cè)序

5、鑒定正確后，克隆到表達(dá)載體pET-32a(+)，將獲得的重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入表達(dá)菌Rosetta，通過(guò)對(duì)誘導(dǎo)溫度、IPTG濃度和誘導(dǎo)時(shí)間的優(yōu)化，確定最佳表達(dá)條件并進(jìn)行大量誘導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)重組Cap蛋白經(jīng)Ni-NTA柱親和層析純化，收集洗脫液，測(cè)定純化蛋白濃度，利用SDS-PAGE分析純化效果。結(jié)果表明:擴(kuò)增出預(yù)期大小為567bp的DuCV GH01株截?cái)郈ap基因片段，且能成功連接到原核表達(dá)載體 pET-32a(+)，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET-

6、32a-cap;經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)條件的優(yōu)化，最終確定了蛋白表達(dá)的最優(yōu)條件為:在30℃、IPTG誘導(dǎo)濃度為0.8mmol/L條件下誘導(dǎo)16h，蛋白表達(dá)量達(dá)到最高值;重組Cap蛋白以包涵體的表達(dá)形式存在，大小約為39kDa。純化后的重組蛋白條帶較清晰，濃度約為1.5mg/mL，DuCV Cap蛋白的成功表達(dá)為后續(xù)試驗(yàn)奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。
　　3.以Cap重組蛋白作為包被抗原檢測(cè)DuCV抗血清的間接ELISA方法的建立與應(yīng)用通過(guò)對(duì)最佳抗原包被濃度

7、、血清最佳稀釋倍數(shù)、最佳包被條件、封閉時(shí)間及最佳酶標(biāo)抗體稀釋倍數(shù)的優(yōu)化，確定間接ELISA方法最佳工作條件，確定陰陽(yáng)臨界值，并對(duì)間接ELISA方法的特異性、敏感性和重復(fù)性進(jìn)行檢測(cè)，最后通過(guò)臨床樣本的檢測(cè)，比較本研究建立的間接ELISA方法和傳統(tǒng)PCR檢測(cè)方法的符合率。結(jié)果顯示，本試驗(yàn)建立的間接ELISA方法的最佳工作條件為:抗原最佳包被濃度為4μg/孔，血清最佳稀釋倍數(shù)為1∶40，包被條件為37℃包被1h后放入4℃冰箱包被過(guò)夜，封閉時(shí)間