豬細(xì)小病毒BQ--C株VP2蛋白的原核表達(dá)與抗體檢測(cè)的間接ELISA方法建立.pdf

1、ProkaryoticExpressionoftheVP2‘ProteinofPorcineParvovirusBQCStrainandEstablishmentoftheIndirectELISAforAntibodyD‘etectionThe“；ubmittedtoItleslssuQingdaoAgriculturalUniversityInFulfillmentoftheRequirementfortheDegreeofMast

2、erofAgronomyLiuZhaoxia(CollegeofAnimalScienceandVeterinaryMedicine)Supervisor：ProfBiKedongProfCuiShangjinQingdaoChinaJune，2013青島農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文摘要豬細(xì)小病毒BQ一C株VP2蛋白的原核表達(dá)與抗體檢測(cè)的間接ELISA方法建立。摘要豬細(xì)小病毒(PPV)是細(xì)小病毒科細(xì)小病毒屬的成員，是引起母豬繁殖障礙的主要病原，

3、嚴(yán)重阻礙了養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展。目前，國(guó)內(nèi)的PPV檢測(cè)試劑盒準(zhǔn)確率均不理想，因此，迫切需要建立一種敏感性高、特異性強(qiáng)、檢測(cè)快速的檢測(cè)方法。VP2蛋白是PPV主要的中和抗原，基因序列相對(duì)比較保守，其在體外表達(dá)的蛋白也具有很強(qiáng)的免疫原性，能夠應(yīng)用于臨床診斷。本研究將VP2蛋白進(jìn)行原核表達(dá)，目的在于建立一種能夠快速檢測(cè)PPV抗體的診斷方法。1根據(jù)GenBank中登錄的PPVBQC株的基因序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物，以ST細(xì)胞培養(yǎng)的PPVBQC株病毒提取的DNA

4、為模板，擴(kuò)增出目的基因，將擴(kuò)增的目的片段插入到原核表達(dá)載體pET30a()中，構(gòu)建出重組表達(dá)質(zhì)粒pETVP2，將表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化Rosetta表達(dá)菌，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，SDSPAGE和Westernblot分析表明VP2蛋白獲得表達(dá)并具有良好的免疫原性。2對(duì)重組蛋白的表達(dá)條件和純化條件進(jìn)行了優(yōu)化，確定重組表達(dá)質(zhì)粒表達(dá)VP2蛋白的最佳條件為：37℃，180rpm振蕩培養(yǎng)至OD600為06—08，加入IPTG至終濃度為10mM，誘導(dǎo)表達(dá)6h，

5、表達(dá)量達(dá)到最高值，經(jīng)SDSPSGE分析表明重組VP2蛋白以包涵體形式存在。應(yīng)用不同濃度的脲素對(duì)包涵體進(jìn)行溶解，經(jīng)SDSPAGE鑒定在4M脲素中蛋白溶解度最大，確定以4M脲素作為蛋白變性劑，應(yīng)用HisBind親和層析柱純化重組蛋白，重組蛋白經(jīng)變性復(fù)性后，Westernblot分析顯示純化后的蛋白具有良好的免疫活性。3利用純化后的重組VP2蛋白作為包被抗原，初步建立了檢測(cè)PPV抗體的間接ELISA方法，對(duì)反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，試驗(yàn)結(jié)果表明：包被

6、液和封閉液分別為2mMpH80麗sHCl和5％脫脂乳，抗原的最佳包被濃度為2ug／mL；血清最佳的稀釋倍數(shù)為1：200，酶標(biāo)二抗的工作濃度為l：6000一抗、二抗工作時(shí)間均為60min，顯色時(shí)間為15min，陰陽(yáng)性臨界值為O271，敏感性、特異性以及重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果表明所建立的方法特異性、敏感性和可重復(fù)性均比較理想。應(yīng)用該檢測(cè)方法對(duì)黑龍江、山東、天津等地區(qū)的596份臨床血清進(jìn)行檢測(cè)，陽(yáng)性檢出率為835％一911％，平均陽(yáng)性檢出率為8703