豬圓環(huán)病毒2型Cap蛋白原核表達及間接ELISA方法的建立.pdf

1、豬圓環(huán)病毒2型(Porcine circovirus type2，PCV2)被公認為在世界范圍養(yǎng)豬業(yè)中造成嚴重經(jīng)濟影響的最重要的病毒之一。由于病毒、宿主的免疫力、混合感染情況和其他環(huán)境特征的差異，PCV2能引起不同的疾病，統(tǒng)稱為圓環(huán)病毒病(porcine circovirusdiseases, PCVDs)。我國是一個養(yǎng)豬大國，PCVDs在我國一直呈上升趨勢，給我國的養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。血清抗體的柃測常被用來分析PCV2的感染情

2、況以及評價疫苗的免疫效果。ELISA因其敏感、特異、檢測快速、簡便等優(yōu)點，而被廣泛應用。然而研究表明，國內(nèi)檢測PCV2抗體的ELISA試劑盒普遍存在敏感性偏低的問題，而進口試劑盒因其價格昂貴，難于普及應用。因此，建立一種快速、簡便、敏感、特異的診斷方法對于PCV2的預防和控制具有重要意義。
　　本研究利用PCR方法擴增PCV2ORF2全長基因，構(gòu)建原核表達載體pET-30a-Cap，轉(zhuǎn)化E.coli BL21(DE3)。在SDS-

3、PAGE分析基礎(chǔ)上，結(jié)合ImageJ和Graphpadprism5.0軟件的分析，對影響重組Cap蛋白表達的誘導溫度，誘導起始OD600，IPTG濃度及誘導時間等因素進行了優(yōu)化，確定最佳表達條件為:當菌體濃度達到1.0～1.5時，加入終濃度為0.2 mM的IPTG，37℃恒溫搖床175 rpm振蕩培養(yǎng)5h。為得到高純度的重組Cap蛋白，對重組Cap蛋白純化條件進行了探索，確定蛋白洗滌液中咪唑濃度為100mM，蛋白洗脫液中咪唑濃度為300

4、 mM。純化后的蛋白進行Western blot鑒定，重組Cap蛋白只與PCV2標準陽性血清反應，與E.coli BL21(DE3)陽性血清和pET-30a/BL21(DE3)陽性血清均不發(fā)生反應，表明純化的重組Cap蛋白具有良好的特異性和反應原性。
　　以純化的重組Cap蛋白為包被抗原，優(yōu)化試驗條件，建立了PCV2 Cap-ELISA檢測方法:抗原包被條件為3μg/mL，4℃包被過夜;封閉液為5％馬血清+2.5％BD脫脂乳，37

5、℃封閉2 h;血清作用條件為200×，37℃孵育45 min;兔抗豬HRP-IgG稀釋度為5000×，37℃孵育45 min;顯色條件為37℃，15 min,利用TG-ROC方法確定臨界值為0.26即當S/P≥0.26時，結(jié)果判定為陽性;S/P＜0.26時，結(jié)果判定為陰性。該方法與PRV陽性血清、TGEV陽性血清、RV陽性血清、PPV陽性血清無交叉反應。組裝的試劑盒的批內(nèi)和批間重復性試驗結(jié)果變異系數(shù)分別為0.32％～7.8％和1.09％