豬流行性腹瀉病毒部分S基因的原核表達(dá)及間接ELISA檢測方法的建立.pdf

1、豬流行性腹瀉(Porcine Epidemic Diarrhea，PED)是由豬流行性腹瀉病毒(Porcine Epidemic Diarrhea Virus，PEDV)引起的豬的一種急性、高度接觸性腸道傳染病。不同年齡和不同品種的豬對本病都易感，但對哺乳仔豬的危害最為嚴(yán)重，以仔豬嘔吐、嚴(yán)重腹瀉和脫水為主要臨床特征。1周齡以內(nèi)的哺乳仔豬于開始腹瀉后2-4d死亡，致死率高達(dá)90％以上，給養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。目前，PED的診斷方法主

2、要有病毒中和試驗(yàn)、免疫熒光法、免疫電鏡法、ELISA和RT-PCR法等。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，間接ELISA法以其敏感性高、特異性強(qiáng)越來越受到人們的重視。 對PEDV的研究表明，S基因編碼的S蛋白是豬流行性腹瀉病毒(PEDV)的主要的結(jié)構(gòu)蛋白，是誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體和提供黏膜免疫保護(hù)作用主要的結(jié)構(gòu)蛋白。與Gen Bank上的其它毒株相比較發(fā)現(xiàn)S基因具有很高的保守性，所以重組S蛋白可作為理想的檢測抗原用于臨床PEDV。本試

3、驗(yàn)為使S蛋白在原核細(xì)胞中得以表達(dá)，針對S基因的保守區(qū)設(shè)計(jì)并合成了一對擴(kuò)增部分S基因的引物P1，P2，以pMD18-T-PS陽性克隆質(zhì)粒為模板，擴(kuò)增出目的片段S1基因，片段大小約為500bp。同時(shí)采用不同的載體系統(tǒng)，探索了S基因的表達(dá)效果，即將豬流行性腹瀉病毒的部分S基因分別亞克隆到原核表達(dá)載體pGEX-6p-1和pET-32a的SalI和NotI之間的多克隆位點(diǎn)上，進(jìn)而構(gòu)建了重組原核表達(dá)質(zhì)粒pGEX-6p-S1和pET-32a-S1。將

4、重組表達(dá)質(zhì)粒pGEX-6p-S1和pET-32a-S1，分別轉(zhuǎn)化到宿主表達(dá)菌BL21(DE3)中，用終濃度為1mmol/L的IPTG對宿主表達(dá)菌誘導(dǎo)表達(dá)。經(jīng)SDS-PAGE分析表達(dá)產(chǎn)物，結(jié)果表明：S1基因在原核表達(dá)系統(tǒng)pGEX-6p-1和pET-32a中獲得表達(dá)，表達(dá)的重組蛋白大小約為20KD。本實(shí)驗(yàn)選擇表達(dá)量較高的pET-32a-S1原核表達(dá)系統(tǒng)，對其進(jìn)行包涵體提取純化，得到純度達(dá)90％以上的重組蛋白。Western blot檢測表明

5、，表達(dá)的重組蛋白能夠被PEDV陽性血清所識(shí)別。由此說明，表達(dá)的重組蛋白具有良好的反應(yīng)原性。 將構(gòu)建的含有豬流行性腹瀉病毒部分S基因原核表達(dá)質(zhì)粒pET-32a-S1進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)之后，純化重組蛋白包涵體，通過Western blot檢測純化后蛋白的反應(yīng)原性。將其作為抗原包被酶標(biāo)板，優(yōu)化間接ELISA試驗(yàn)條件，建立可檢測PEDV血清抗體的間接ELISA方法。 利用已建立的ELISA方法對吉林省豬場進(jìn)行血清學(xué)檢測，檢測100份臨