豬流行性腹瀉病毒熒光定量PCR方法和間接ELISA方法的建立與初步應(yīng)用.pdf

1、豬流行性腹瀉(PED)是由豬流行性腹瀉病毒(PEDV)引起的豬的一種高度接觸性腸道傳染病，以嘔吐、腹瀉和食欲下降為基本特征，各種年齡階段的豬可能感染，但仔豬最易感。該病最初發(fā)現(xiàn)時(shí)發(fā)病率高，死亡率較低，但是近年來PEDV引起山東的仔豬腹瀉爆發(fā)，病死率達(dá)100％。為了有效防治該病，本研究建立了檢測(cè)PEDV的熒光定量PCR診斷方法和檢測(cè)PEDV抗體的間接ELISA檢測(cè)方法。本研究共分為三個(gè)部分:
　　1 PEDV熒光定量PCR的建立

2、r>　　根據(jù)PEDV的M基因序列，本研究合成了針對(duì)該序列的Taqman探針和引物，建立了檢測(cè)PEDV的絕對(duì)熒光定量PCR方法，繪制了標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=-2.146X+22.769，各個(gè)參數(shù)為Slope=-2.146，擴(kuò)增效率:E=10-1/斜率-1=10-1/-2.146-1=192.433％，相關(guān)系數(shù):R2=0.994。試驗(yàn)證明該方法特異性強(qiáng)、重復(fù)性好、靈敏度高、最低可檢測(cè)到10copies/μL。應(yīng)用建立的熒光定量PCR對(duì)來自山東省

3、的40份臨床呈腹瀉癥狀的病料進(jìn)行了檢測(cè)，檢測(cè)出30份PEDV陽(yáng)性，檢出率為75％，說明PEDV引起山東省大部分豬場(chǎng)的仔豬腹瀉的原因之一。
　　2 PEDVN基因的原核表達(dá)
　　本試驗(yàn)設(shè)計(jì)引物，以PEDV山東流行株DZ12-3為模板，擴(kuò)增了全長(zhǎng)的N基因，并連接到pET-30a載體上，構(gòu)建了重組表達(dá)質(zhì)粒，導(dǎo)入表達(dá)菌E.coli BL21(DE3)，通過對(duì)表達(dá)時(shí)間，誘導(dǎo)劑的使用量，溫度等條件的摸索，使構(gòu)建的pET30a-PEDVN

4、質(zhì)粒在BL21中大量穩(wěn)定的表達(dá)，并且最佳的表達(dá)條件確定為1mM/mL的IPTG，37℃，220r/min，表達(dá)6h時(shí)表達(dá)量最大。經(jīng)過Ni-Agarose柱純化獲得純度較高的目的蛋白，Western blot檢測(cè)表明，表達(dá)的重組N蛋白能與PEDV陽(yáng)性血清發(fā)生特異性反應(yīng)，不與其他常見豬病陽(yáng)性血清發(fā)生反應(yīng)，說明該蛋白具有一定的反應(yīng)原性。
　　3 PEDV間接ELISA方法的建立和應(yīng)用
　　本研究使用純化的原核表達(dá)N蛋白為包被抗原建

5、立了檢測(cè)豬體內(nèi)PEDV抗體的間接ELISA方法。優(yōu)化條件為N蛋白最佳包被量為750ng/孔，最佳包被條件為使用碳酸鹽緩沖液（0.05mol/L，pH9.6）、4℃包被12h，被檢豬血清最佳稀釋度為1∶100，抗體最佳反應(yīng)時(shí)間為37℃，1h，顯色液的最佳終止時(shí)間為室溫15min，陽(yáng)性的Cut-off值為0.465。
　　以建立的間接ELISA方法對(duì)采自山東省的320份PEDV疫苗免疫豬血清進(jìn)行抗體檢測(cè)，結(jié)果表明總的抗體陽(yáng)性率為62.

6、81％，母豬抗體陽(yáng)性率為72.2％，仔豬抗體陽(yáng)性率為46.1％，表明疫苗免疫的抗體陽(yáng)性率不高;檢測(cè)德州2個(gè)未免疫PEDV疫苗的豬場(chǎng)120份血清，統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，總的感染抗體陽(yáng)性率為36.7％，母豬的感染抗體陽(yáng)性率為42.9％，育肥豬感染抗體陽(yáng)性率為28.0％，表明豬場(chǎng)中存在PEDV野毒的普遍感染;通過對(duì)某豬場(chǎng)免疫PEDV疫苗后抗體跟蹤監(jiān)測(cè)顯示，7d后抗體開始上升，28d左右達(dá)到最高，35d后出現(xiàn)下降，整體抗體水平不高，表明PEDV疫苗免疫