豬流行性腹瀉病毒的分離及間接ELISA的建立.pdf

1、豬流行性腹瀉（Porcine Epidemic Diarrhea，PED）是世界范圍內(nèi)發(fā)生的豬病之一，1978年在英國和比利時(shí)首次被報(bào)道，此后歐洲、亞洲的多個(gè)國家相繼報(bào)道了PED的發(fā)生，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。當(dāng)前，PED發(fā)生率居高不下，并出現(xiàn)混合感染的報(bào)道（如豬傳染性胃腸炎、豬輪狀病毒、豬圓環(huán)病毒2型），倍受廣大研究者的重視。本研究對(duì)豬流行性腹瀉病毒(Porcine Epidemic Diarrhea Virus，PEDV)進(jìn)行分離鑒定和

2、分子流行病學(xué)調(diào)查及建立其抗體的間接ELISA診斷方法，以進(jìn)一步了解PEDV廣西流行毒株的特點(diǎn)，為下一步研制PEDV疫苗、制備診斷試劑盒提供理論指導(dǎo)，為更好地防控PED奠定基礎(chǔ)。
　　 了解當(dāng)前PEDV在廣西的流行情況，本研究用RT-PCR方法對(duì)2011年2月至2013年1月間從廣西11個(gè)市采集的240份腹瀉仔豬樣品進(jìn)行PEDV檢測，發(fā)現(xiàn)PEDV陽性率為41.7％(100/240)，四個(gè)季度均存在PEDV的感染，其中春、冬季節(jié)的檢

3、出率最高，分別為49％和46.2％。調(diào)查結(jié)果表明，在廣西大部分地區(qū)的豬群中普遍存在流行性腹瀉病毒感染。對(duì)陽性材料進(jìn)行克隆，獲得了14條M基因序列和20條ORF3基因序列。用DNAStar、MEGA5.0軟件將其與國內(nèi)外相應(yīng)的基因序列進(jìn)行比較分析發(fā)現(xiàn)，本實(shí)驗(yàn)所獲得的M、ORF3序列差異較大，它們與2010年以來我國廣東、福建、江蘇、江西四省的同源性均較高，與泰國、韓國2007年以來的流行毒株親緣關(guān)系也非常密切，但與我國2006年前分離的毒

4、株及CV777株、日韓弱毒株較遠(yuǎn)。且在從腹瀉仔豬樣品克隆所得的序列中，有1條M基因序列與CV777疫苗株相近，有3條ORF3序列與CV777、attenuated-DR13疫苗株存在相似的49個(gè)核苷酸的連續(xù)缺失。這些結(jié)果提示我們要加強(qiáng)對(duì)PEDV的研究與監(jiān)控，采取更有針對(duì)性的免疫與防控措施。本次研究是首次對(duì)廣西當(dāng)前的流行毒株進(jìn)行比較深入的分子流行病學(xué)調(diào)查。
　　 為進(jìn)一步了解廣西流行毒株的生物學(xué)特性，研究通過用VERO細(xì)胞對(duì)40份

5、陽性材料進(jìn)行分離，經(jīng)RT-PCR鑒定和間接ELISA鑒定，獲得一株能穩(wěn)定傳代并能使細(xì)胞發(fā)生空泡化、溶解、相互融合、出現(xiàn)拉網(wǎng)等細(xì)胞病變的毒株，命名為PEDV-LB。對(duì)其S、ORF3、M、N4個(gè)基因進(jìn)行克隆測序，并將其與國內(nèi)外相應(yīng)的基因序列進(jìn)行同源性比較與遺傳進(jìn)化樹分析，發(fā)現(xiàn)ORF3基因、M基因與CV777等弱毒株比較相近;N基因與CH/GDS/09，親緣關(guān)系最近，與CV777不在同一分支上;S基因變異較大，與我國2011年的流行毒株同源關(guān)

6、系較近，與CV777等距離較遠(yuǎn)。根據(jù)CV777全基因序列設(shè)計(jì)引物進(jìn)一步對(duì)PEDV-LB株全基因進(jìn)行克隆，結(jié)果獲得了除5'端、3'端及部分Pol基因外的全基因大部分核苷酸序列，共25，094bp。
　　 為了建立PEDV抗體檢測的間接ELISA診斷方法，本研究對(duì)廣西流行毒株的N基因進(jìn)行克隆，設(shè)計(jì)合成引物擴(kuò)增其局部強(qiáng)親水性抗原決定簇基因區(qū)域（135-319位氨基酸）NB，構(gòu)建了NB-PET32a-BL21重組原核表達(dá)質(zhì)粒，經(jīng)IPTG

7、誘導(dǎo)獲得重組N蛋白。SDS-PAGE電泳結(jié)果表明表達(dá)產(chǎn)物部分可溶，經(jīng)Western-Blot鑒定，表達(dá)的重組N蛋白含有His-Tag，能夠被抗His的抗體識(shí)別，還能PEDV陽性血清所識(shí)別，具有良好的抗原性。將純化的重組N蛋白包作為抗原包被酶標(biāo)板，通過優(yōu)化反應(yīng)條件，建立了檢測PEDV抗體的間接ELISA方法。用該方法對(duì)廣西不同地區(qū)的12個(gè)豬場的704份血清樣品進(jìn)行檢測，結(jié)果它們的陽性率為31.4％～92.9％。該診斷方法具有準(zhǔn)確、快速、操