豬流行性腹瀉病毒AJ1102株的分離、鑒定及其分子進(jìn)化特征.pdf

1、豬流行性腹瀉（porcine epidemicdiarrhea，PED）是由豬流行性腹瀉病毒(PEDV)引起的一種以腹瀉、嘔吐和脫水為主要特征的豬腸道傳染病。該病1971年首次在英國(guó)被發(fā)現(xiàn)，隨后，其它歐洲國(guó)家和部分亞洲國(guó)家相繼報(bào)道了該病的發(fā)生與流行。以前，美國(guó)從未出現(xiàn)PEDV，但從2013年5月以來(lái)，美國(guó)多個(gè)州發(fā)生PEDV的流行，引起了美國(guó)乃至全球養(yǎng)豬業(yè)的高度重視。
　　我國(guó)是上世紀(jì)80年代初首次發(fā)生PEDV。由于該病對(duì)新生仔豬的

2、感染率和致死率均很高，給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。2010年冬季以來(lái)，流行性腹瀉在我國(guó)10多個(gè)省市暴發(fā)并呈現(xiàn)新的流行特征:發(fā)病率和致死率高、流行廣、損失大，而且以前接種過(guò)豬流行性腹瀉疫苗的豬也未能幸免，提示該流行毒株毒力較強(qiáng)，而且可能與現(xiàn)有疫苗毒株存在較大的差異，導(dǎo)致現(xiàn)有疫苗難以提供免疫保護(hù)。有意義的是，美國(guó)2013年流行的PEDV在基因組水平上與我國(guó)流行的PEDV同源性高達(dá)99.5％，稱為中國(guó)變異株。針對(duì)當(dāng)前流行的豬流行性腹瀉病毒，

3、本研究開(kāi)展了檢測(cè)方法的建立、病毒的分離與鑒定，同時(shí)，對(duì)流行毒株的遺傳進(jìn)化特征進(jìn)行了深入研究。主要研究?jī)?nèi)容如下:
　　1.PEDV RT-PCR檢測(cè)方法的建立及其流行病學(xué)調(diào)查
　　針對(duì)PEDV高度保守的M基因設(shè)計(jì)了一對(duì)特異性引物，建立了PEDV的RT-PCR檢測(cè)方法，該引物擴(kuò)增片段大小為552bp。該方法特異性好、敏感性高，并且檢測(cè)速度快，適于大樣品的檢測(cè)。利用建立的RT-PCR方法，對(duì)2010至2011年間從華中、華東、華南

4、等地區(qū)9個(gè)省份采集的600多份臨床樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示不同地區(qū)的臨床樣品其PEDV陽(yáng)性率均超過(guò)50％，平均陽(yáng)性率為58.32％，表明PEDV在我國(guó)流行十分廣泛，感染率相當(dāng)高。
　　2.PEDVAJ1102株的分離、鑒定
　　盡管PEDV的感染率很高，但國(guó)內(nèi)外的研究表明，豬流行性腹瀉病毒的分離相當(dāng)困難、分離的成功率極低。將采自湖北省某豬場(chǎng)發(fā)病仔豬的臨床樣品接種Vero細(xì)胞，盲傳3代后有一份臨床樣品接種的細(xì)胞可觀察到明顯的細(xì)胞

5、病變，主要表現(xiàn)為細(xì)胞形成空泡的合胞體的病變，最后細(xì)胞發(fā)生裂解，PEDV特異性RT-PCR檢測(cè)也證實(shí)為陽(yáng)性;進(jìn)一步采用間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)證實(shí)病變的細(xì)胞能與PEDV特異性單克隆抗體發(fā)生反應(yīng)，空斑實(shí)驗(yàn)測(cè)定該分離病毒滴度達(dá)106.0PFU/ml（F5代）。對(duì)分離的病毒通過(guò)梯度離心純化并采用電子顯微鏡進(jìn)行鑒定，能觀察到直徑大小約為100nm的病毒粒子以及明顯的囊膜和纖突，具有典型的PEDV病毒粒子形態(tài)特征，證實(shí)所分離的病毒為PEDV，命名為PEDV

6、 AJ1102株。
　　3.PEDVAJ1102株的全基因組序列測(cè)定與遺傳進(jìn)化分析
　　參考以前所報(bào)道的PEDV全基因組序列，設(shè)計(jì)了16對(duì)引物，通過(guò)分段擴(kuò)增的方法對(duì)PEDVAJ1102株進(jìn)行了全基因組序列測(cè)定。結(jié)果表明:AJ1102株全基因組全長(zhǎng)28044bp(GenBank accession number JX188454)，基因組排列與PEDV經(jīng)典毒株CV777一樣，排列順序均為5'-ORF1a-ORF1b-S-ORF

7、3-E-M-N-3'。將AJ1102株以及目前國(guó)內(nèi)外已測(cè)定全基因組序列的其它31株P(guān)EDV毒株進(jìn)行比較，并利用MEGA4軟件繪制系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，發(fā)現(xiàn)32株P(guān)EDV可分為兩個(gè)大群即Ⅰ群和Ⅱ群;其中Ⅰ群和Ⅱ群又被分為兩個(gè)亞群即Ⅰa、Ⅰb及Ⅱa、Ⅱb。Ⅱ群主要由國(guó)內(nèi)2010年以后報(bào)道的毒株以及2013年美國(guó)流行毒株組成。AJ1102株屬于Ⅱa亞群，為新型的PEDV變異株，與處于Ⅰa亞群的經(jīng)典毒株CV777遺傳關(guān)系較遠(yuǎn)。
　　4.PEDVAJ

8、1102株主要基因的遺傳進(jìn)化分析
　　本研究比較分析了AJ1102株5'UTR、3'UTR區(qū)域以及結(jié)構(gòu)蛋白M、N、S、E和非結(jié)構(gòu)蛋白ORF3的遺傳進(jìn)化特征。與經(jīng)典毒株CV777相比，AJ1102株的5'UTR有5個(gè)堿基缺失、1個(gè)堿基插入和8個(gè)堿基突變;3'UTR無(wú)缺失或插入，但有10個(gè)堿基的突變;S基因的變異位點(diǎn)主要出現(xiàn)在S1區(qū)域(1-2217nt)，包括3個(gè)插入?yún)^(qū)域(168nt，176-186nt，431-433nt)和1個(gè)缺失

9、區(qū)域(493-498nt)，而且AJ1102株S蛋白的核心抗原表位區(qū)(COE)有8個(gè)氨基酸突變，SS6(772LQDGQVKI779)抗原表位有1個(gè)氨基酸突變;M基因、N基因、ORF3和E基因均無(wú)插入或缺失，但存在一些堿基突變。對(duì)M、N、S、E、ORF3和E基因的進(jìn)化分析顯示，AJ1102株均與2010年以后分離的毒株處在同一分支，而與經(jīng)典毒株CV777遺傳關(guān)系較遠(yuǎn)，表明AJ1102株是當(dāng)前的流行毒株，是研制針對(duì)當(dāng)前PEDV流行毒株疫苗

10、的候選毒株。
　　5.PEDV流行毒株的遺傳標(biāo)志
　　根據(jù)對(duì)全基因組以及主要結(jié)構(gòu)蛋白的遺傳進(jìn)化分析，發(fā)現(xiàn)流行毒株S基因的S1區(qū)域具有較大的變異。為了探討該區(qū)域是否具有目前我國(guó)PEDV流行毒株的特征性變異或遺傳標(biāo)記，針對(duì)S1區(qū)域的主要變異區(qū)設(shè)計(jì)了一對(duì)可擴(kuò)增約450bp片段的特異性引物，對(duì)61份臨床樣品進(jìn)行了RT-PCR擴(kuò)增與序列分析，發(fā)現(xiàn):目前在我國(guó)流行的PEDV毒株的S1基因具有特征性變異，提示這一特征性變異可以作為區(qū)分流行

11、毒株和經(jīng)典毒株的遺傳標(biāo)志，在實(shí)際操作中我們可以通過(guò)對(duì)該區(qū)域的檢測(cè)，以確定特定豬場(chǎng)的PEDV是變異毒株還是經(jīng)典毒株，為疫苗的選擇提供理論依據(jù)。
　　6.姜黃素對(duì)PEDV增殖的抑制作用研究
　　中草藥姜黃素不僅具有抗炎、抗腫瘤、抗氧化、抗誘變的作用，而且還具有抗病毒的作用，其對(duì)乙型肝炎病毒(HBV)，丙型肝炎病毒(HCV)、人類免疫缺陷病毒等多種病毒均具有明顯的抑制效果。然而姜黃素對(duì)PEDV是否具有抗病毒作用還未見(jiàn)報(bào)道。本研究利