豬流行性腹瀉病毒YX株的分離鑒定及其滅活疫苗免疫效力試驗研究.pdf

1、豬流行性腹瀉（PED）是由冠狀病毒屬的豬流行性腹瀉病毒（PEDV）引起的一種以仔豬水樣腹瀉、嘔吐、脫水為主要特征的接觸性腸道傳染病。豬流行性腹瀉是世界上流行最廣泛的豬病之一。近年，豬流行性腹瀉作為烈性傳染病，開始瘋狂肆虐我國廣大養(yǎng)殖戶。我國的廣東、廣西、江西、湖南、福建、浙江、安徽、江蘇、湖北、河北和山東等?。ㄗ灾螀^(qū)）均有豬流行性腹瀉的發(fā)現(xiàn)。PED在我國的流行面逐漸擴大，對26個省市自治區(qū)的調(diào)查表明PED的總死亡率占36種疾病總死亡率的

2、1.74％。該病多發(fā)于冬春季節(jié)，但就廣東地區(qū)這個全年高濕度的環(huán)境，PED呈高發(fā)趨勢，全年均可發(fā)生，7天齡內(nèi)的新生仔豬在發(fā)生腹瀉后3?4天，通常因脫水導致衰竭而死亡，病死率高達100%。目前，在廣東粵西地區(qū)，豬流行性腹瀉呈高發(fā)趨勢，一旦進入冬春季節(jié)，該病都是大規(guī)模爆發(fā)，病死率高。雖然可以采取疫苗接種方式來控制此病流行，但經(jīng)典的CV777株疫苗免疫后效果并不理想，接種過疫苗的豬場仍然有此病的流行。本研究主要分為下面三個部分：
　　1、

3、PEDV-YX株的分離鑒定。本研究從廣東粵西9個疑似發(fā)生腹瀉疫情的規(guī)?；i場采集180份病料樣本。通過在Vero細胞培養(yǎng)基中添加胰酶的方法孵育、選取1%接毒量接種 Vero單層細胞，進行病毒分離純化，從中分離出9株未知病毒HS1、HS2、HS3、HS4、YC1、YC2、YC3、YC4和KP，經(jīng)膠體金快速診斷技術、RT-PCR擴增、基因序列比對，確診均為豬流行性腹瀉病毒（PEDV）。通過豬體回歸試驗，選取臨床癥狀最明顯，毒力最強的YC1毒

4、株作為研究對象，命名為PEDV-YX株。在胰酶總濃度為7.5ug/ml的作用下，盲傳到第8代，能觀察到細胞圓縮、聚集，空泡增多等明顯的細胞病變。
　　2、對PEDV-YX株生物學特性、中和試驗及其TCID50測定研究。對PEDV-YX株生物學特性、中和試驗及其TCID50研究表明，該分離株對5-BrdU不敏感，為具有囊膜的RNA病毒；對乙醚、氯仿敏感；在pH為3.0的環(huán)境下易失活；對熱敏感，在50℃條件下作用1h，病毒易失活；設計

5、特異性引物，進行RT-PCR擴增，電泳檢測得到與預期長度一致的條帶；與PEDV抗血清中和效價為120.23；PEDV-YX F10的TCID50為10-5.67/0.1ml。
　　3、PEDV-YX株氫氧化鋁膠滅活疫苗制備及不同免疫劑量、不同免疫途徑對抗體水平的影響研究。PEDV-YX株F10經(jīng)0.3%的甲醛溶液滅活，以病毒液樣40ml+PBS40ml+20ml鋁膠佐劑的培苗方案，配制豬流行性腹瀉滅活疫苗。以口服免疫、后海穴注射免

6、疫為免疫途徑，2ml、1ml、0.5ml不同免疫劑量，研究該滅活疫苗的抗體消長規(guī)律。當免疫劑量相同時，后海穴注射免疫比口服免疫抗體效價更高，且抗體維持時間更長；當免疫途徑相同時，免疫2ml的抗體整體水平比免疫1ml的更高，免疫0.5ml的中和抗體水平最低。
　　通過分離廣東粵西地區(qū)PEDV的流行性毒株，為了解該地區(qū)流行性毒株的特性及流行情況，建立PEDV快速準確的診斷方法及新型疫苗的研究提供理論依據(jù)，從而為制定有效的防控措施，促進