豬流行性腹瀉病毒(PEDV)基因工程疫苗載體構(gòu)建及重組病毒拯救.pdf

1、豬流行性腹瀉（Porcine epidemic diarrhea，PED）是由豬流行性腹瀉病毒（Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）引起的急性"接觸性"高度傳染性消化道疾病，主要癥狀為嘔吐、水樣腹瀉和脫水。PED的波及范圍廣，在全球均有病例報(bào)道。近幾年，該病在中國(guó)廣泛蔓延，造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，引起了中國(guó)各研究單位對(duì)其病原PEDV的關(guān)注。
　　目前，PEDV商品化疫苗保護(hù)效力在逐年降低，主要有

2、兩個(gè)原因，一是目前商品化疫苗與流行毒株的抗原性不匹配，二是減活疫苗毒株由于體外適應(yīng)傳代培養(yǎng)而被過度弱化。因此，新型疫苗的開發(fā)具有重要意義。本研究旨在通過靶向RNA重組反向操作平臺(tái)，將2013年流行的3株細(xì)胞適應(yīng)毒株的S基因分別替換掉原疫苗株（DR13）S基因，最終裝配出3株重組疫苗毒株作為疫苗候選毒株，為后期研發(fā)的新一代減毒活疫苗奠定基礎(chǔ)。
　　本研究分為兩個(gè)部分。
　　第一部分：構(gòu)建豬流行性腹瀉病毒基因工程疫苗載體。選擇三

3、株2013年流行的細(xì)胞適應(yīng)毒株KF804028, KF650372, KF650375的S基因作為免疫原性基因。根據(jù)Genbank中 KF804028， KF650372, KF650375的S基因的序列，通過引物小片段(三條基因共94段)進(jìn)行overlap PCR，形成一級(jí)片段，將融合得到的一級(jí)片段連接pJET-Blunt載體進(jìn)行克隆并且測(cè)序。選擇測(cè)序正確的Blunt載體，用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，形成13段正確的一級(jí)片段。將相鄰有21b

4、p堿基重合區(qū)域的一級(jí)片段再次進(jìn)行PCR片段融合，形成二級(jí)片段，同樣的方法，逐級(jí)放大至四級(jí)片段，合成出3段PED流行毒株 S(4161bp)基因。PED流行毒株 S(4161bp)基因通過同源重組的方法與p-PEDV-ΔS DR13連接，并且克隆測(cè)序，從而獲得正確的重組質(zhì)粒，即豬流行性腹瀉病毒（PEDV）基因工程疫苗載體。三個(gè)重組質(zhì)粒分別命名為pPEDV-DR13ΔS/ KF804028 S、pPEDV-DR13ΔS/ KF650372

5、S、pPEDV-DR13ΔS/ KF650375 S。
　　第二部分：重組病毒的拯救。將已經(jīng)構(gòu)建好的三個(gè)攜帶流行的細(xì)胞適應(yīng)毒株S基因的重組質(zhì)粒體外轉(zhuǎn)錄成RNA，通過電轉(zhuǎn)，使流行毒株的S基因整合進(jìn)入PEDV病毒基因組，再將重組的PEDV（rPEDV）感染VERO細(xì)胞，從而獲得能夠在VERO細(xì)胞上產(chǎn)生CPE并且連續(xù)傳代的重組PEDV。三個(gè)重組病毒分別命名為PEDV-DR13ΔS/KF804028 S、PEDV-DR13ΔS/ KF65