豬流行性腹瀉病毒S蛋白不同基因片段重組腺病毒的構建與小鼠免疫特性研究.pdf

1、豬流行性腹瀉病毒(PEDV)是引起豬腹瀉和死亡的重要病原之一。目前，雖然商品化PEDV疫苗已普遍使用，但該病在我國仍有流行，并引起嚴重的經(jīng)濟損失。因此，研制一種新的有效的PEDV疫苗十分必要。 S蛋白是在PEDV的重要結構蛋白，可誘導機體產(chǎn)生中和抗體，是研究PEDV基因工程疫苗的主要目的基因。本研究利用RT-PCR技術把S基因的三個片段S<,498-638>、S<,1-638>和S<,639-1384>分別克隆入腺病毒表達載體系

2、統(tǒng)中，成功構建了三個重組腺病毒rAd-S<,498-638>、rAd-S<,1-638>和rAd-S<,639-1384>，并在小白鼠體內(nèi)進行免疫特性研究，為研究PEDV重組腺病毒疫苗奠定基礎。 本研究根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中的PEDV基因序列(No.AY653204)設計了四條引物P1、P2、P3、P4，其中P1和P3分別含有KpnI酶切位點和起始密碼子ATG，P2和P4分別含有XhoI酶切位點和終止密碼子TAA、TGA。其

3、中引物P1和P2用于擴增s蛋白核心抗原基因第498-638位的氨基酸的基因片段S<,498-638>，P3和P2用于擴增S蛋白的第1-638位氨基酸的基因片段S<,1-638>，P1和P4用于擴增S蛋白第639-1384位氨基酸的基因片段S<,639-1384>，通過RT-PCR技術從國內(nèi)分離的PEDV JS株中分別擴增獲得大小為426bp，1917bp，2661bp的PCR產(chǎn)物，經(jīng)純化后與穿梭載體pShuttle-CMV同時進行雙酶切

4、，分別經(jīng)回收后連接。連接產(chǎn)物轉化DH5a，然后在卡那霉素抗性(Kan<'r>)平板上挑取陽性菌落，37℃過夜培養(yǎng)。提取質粒經(jīng)KpnI和XhoI雙酶切鑒定，結果所克隆的片段與預期片段大小相符；DNA測序分析結果表明，所插入的基因片段閱讀框完全正確，3個基因片段基因序列和PEDV JS株的S基因片段的對應序列的同源性分別為98.6％，97.4％，98.4％。將鑒定正確的重組質粒pShuttle-CMV-S<,498-638>、pShuttl

5、e-CMV-S<,1-638>和pShuttle-CMV-S<,639-1384>分別用PmeI進行線性化，然后電轉化進含有骨架載體pAdEasy-1的BJ5183感受態(tài)細胞中，經(jīng)過同源重組，在具有卡那霉素的LB平板上篩選陽性菌落，然后利用PacI對重組質粒進行酶切鑒定，結果與預計的相符，陽性重組質粒分別命名為pAd-S<,498-638>，pAd-S<,1-638>，pAd-S<,639-1384>；經(jīng)鑒定后，將三個重組質粒大量提取，

6、PacI酶切線性化，陽離子脂質體法轉染到HEK293A細胞，于37℃培養(yǎng)7天后出現(xiàn)細胞病變，收獲病毒。經(jīng)噬斑純化，用間接免疫熒光試驗(IFA)鑒定三個重組腺病毒s基因片段的表達，結果表明重組腺病毒中的三個蛋白基因能夠在HEK293A細胞中轉錄和表達，分別命名為rAd-S<,498-638>，rAd-S<,1-638>，rAd-S<,639-1384>。將重組病毒在293細胞上連續(xù)傳代至20代，每傳5代測定病毒滴度一次，其滴度穩(wěn)定TCID

7、<,50>分別為10<'-6.29>/ml、10<'-5.75>/ml、10<'-6.5>/ml。將100只18-20g的雌性小白鼠隨機分為5組，每組20只。第1、2和3組分別免疫三個重組腺病毒rAd-S<,498-638>，rAd-S<,1-638>和rAd-S<,639-1384>，第4、5分別免疫野生型腺病毒(wtAd)和PBS以作為陰性對照和空白對照。通過皮下注射途徑分別進行免疫。首免后間隔14d加強免疫一次，共免疫兩次。分別于

8、首次免疫后14、28、42、56d，每組隨機取出5只小鼠采血測定EuSA抗體，并取小鼠脾通過MTT法進行淋巴細胞轉化試驗。首免后42d的小鼠血清每組取3份測定中和抗體。結果顯示：在三個免疫組的小白鼠血清均能夠檢測到一定水平的EusA特異性IgG和病毒特異性中和抗體，且在二免后28天(即首免后42天)其OD<,450>值均能達到一個最高值，其中rAd-S<,498-638>所產(chǎn)生的ELISA抗體和中和抗體均最高，另外兩組則較低。但這三個重