兩株攜帶豬流行性腹瀉病毒S蛋白抗原區(qū)域的減毒沙門氏菌的構(gòu)建與免疫規(guī)律研究.pdf

1、豬流行性腹瀉(Porcine epidemic diarrhea，PED)是由豬流行性腹瀉病毒(Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)引起的以嘔吐、腹瀉、脫水和哺乳仔豬高致病率、高死亡率為主要特征的一種接觸性腸道傳染病，給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。PEDV的S蛋白是誘導(dǎo)產(chǎn)生保護(hù)性中和抗體的結(jié)構(gòu)蛋白。本研究進(jìn)行了S蛋白抗原區(qū)域的篩選，分別構(gòu)建了攜帶PEDV S蛋白主要抗原區(qū)域S499-650和S499

2、-789區(qū)域的重組減毒沙門氏菌疫苗，并以小鼠和仔豬為模型進(jìn)行了口服免疫規(guī)律研究。
　　1.S基因的兩種真核表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定
　　根據(jù)GenBank中PEDV SC-L株S基因序列，設(shè)計(jì)特異性引物，采用RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增并克隆了S499-650、S499-789基因，并分別將S499-650、S499-789基因插入真核表達(dá)質(zhì)粒pVAX1中，構(gòu)建重組真核表達(dá)質(zhì)粒pVAX-S499-650、pVAX-S499-789，然后

3、轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞，通過間接免疫熒光及Western-blotting進(jìn)行了蛋白表達(dá)鑒定，重組真核表達(dá)質(zhì)粒可在COS-7細(xì)胞中表達(dá)目的蛋白，表達(dá)的蛋白可與兔抗PEDV陽性血清發(fā)生特異性反應(yīng)，證明真核表達(dá)載體構(gòu)建成功。
　　2.兩株攜帶S基因的重組減毒沙門氏菌的構(gòu)建及生物學(xué)特性研究
　　將真核表達(dá)質(zhì)粒pVAX-S499-650、pVAX-S499-789分別電轉(zhuǎn)化入減毒鼠傷寒沙門氏菌SL7207，構(gòu)建了重組減毒沙門氏菌菌株SL

4、7207(pVAX-S499-650)、SL7207(pVAX-S499-789)。將這兩株重組菌株分別以1×109 CFU/只劑量口服免疫小鼠，對(duì)重組菌株在小鼠體內(nèi)的穩(wěn)定性、攜帶目的基因在體內(nèi)的轉(zhuǎn)錄、小鼠體內(nèi)的增殖、對(duì)小鼠的安全性等菌株生物學(xué)特性進(jìn)行研究。結(jié)果表明，SL7207(pVAX-S499-650)、SL7207(pVAX-S499-789)兩株口服菌株均具有較高的穩(wěn)定性;攜帶的目的基因可在腸道組織內(nèi)轉(zhuǎn)錄;重組菌在小鼠肝、脾中

5、增殖約5周后逐漸被機(jī)體清除;重組菌株對(duì)小鼠具有良好的安全性。本研究結(jié)果表明減毒鼠傷寒沙門氏菌SL7207可作為PEDV S基因不同抗原片段的呈遞載體，為后續(xù)開展兩種菌株的豬體口服免疫效果比較研究奠定了基礎(chǔ)。
　　3.重組減毒沙門氏菌的口服免疫原性研究
　　將15頭仔豬，分成5組，分別以1×1012 CFU/頭劑量口服免疫重組菌株SL7207(pVAX-S499-650)、SL7207(pVAX-S499-789)，同時(shí)設(shè)PE

6、DV滅活苗陽性對(duì)照免疫組和SL7207(pVAX)、PBS陰性對(duì)照免疫組，兩周后加強(qiáng)免疫一次。在首免第0、2、4、6周采集免疫仔豬血清樣品及黏膜樣品，測(cè)定血清IgG與腸道黏膜抗體IgA的動(dòng)態(tài)規(guī)律與中和活性、血清細(xì)胞因子IFN-γ、血清IL-4，外周血T淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示:SL7207(pVAX-S499-650)、SL7207(pVAX-S499-789)可誘導(dǎo)產(chǎn)生一定水平的血清IgG、黏膜IgA，且抗體具有良好的病毒中和活性，

7、其中，口服疫苗誘導(dǎo)體液IgG的能力不如滅活苗，但誘導(dǎo)黏膜IgA的能力優(yōu)于滅活苗;外周血T淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)則表明SL7207(pVAX-S499-650)、SL7207(pVAX-S499-789)具有良好的免疫原性，可有效刺激T淋巴細(xì)胞的增殖;血清中細(xì)胞因子測(cè)定顯示:SL7207(pVAX-S499-650)、SL7207(pVAX-S499-789)可激發(fā)IFN-γ的分泌，但對(duì)IL-4的分泌無明顯刺激作用，表明二株口服疫苗菌株主要誘導(dǎo)