表達Tsol18抗原的口服減毒鼠傷寒沙門氏菌重組活載體疫苗的構建及其免疫學研究.pdf

1、囊尾蚴病(Cysticercosis)是由豬帶絳蟲(Taeniasolium)的幼蟲囊尾蚴(Cysticercuscellulosae)寄生于人或豬等而引起的人畜共患寄生蟲病，是公認的世界經濟病之一。囊尾蚴病在中國大部分地區(qū)尤其在少數(shù)民族地區(qū)是一個重要的公共衛(wèi)生問題，嚴重威脅著人體健康，不僅如此，豬囊尾蚴病的廣泛存在極大影響了我國畜產品在國際市場上的競爭力，給畜牧業(yè)造成重大經濟損失，豬囊尾蚴病的免疫防治勢在必行，然而在豬囊尾蚴病疫苗研究

2、中，疫苗抗原的選擇和來源一直困擾著獸醫(yī)工作者。Tsol18是豬帶絳蟲六鉤蚴(T.soliumoncosphere)階段特異性表達的抗原，主要在六鉤蚴感染中間宿主的早期階段分泌，其免疫血清在體外試驗中能殺死六鉤蚴，是豬囊尾蚴病疫苗研制的主要候選抗原之一。在已有的研究中，Tsol18重組蛋白在原核系統(tǒng)中多以包涵體形式表達，給蛋白質的復性和純化帶來許多困難，并且包涵體活性較低、保存期短、降解快，因而限制了Tsol18在豬囊尾蚴病疫苗研制上的應

3、用。 鼠傷寒沙門氏菌(Salmonellatyphimurium)是一種常見的侵襲性胞內菌，通過基因工程方法減毒后對宿主致病性顯著降低，但仍保留良好的侵襲力，可將免疫抗原直接遞呈給免疫細胞而誘導特異性的免疫應答反應，減毒鼠傷寒沙門氏菌作為口服疫苗載體是目前疫苗免疫研究的熱點之一。為了優(yōu)化豬囊尾蚴病疫苗候選抗原Tsol18重組蛋白，探索豬囊尾蚴病口服重組活載體疫苗的免疫應答，研究其在豬囊尾蚴病免疫預防上的作用，進行了本項研究。

4、 收集成熟的豬帶絳蟲蟲卵，經孵化和激活后，提取六鉤蚴總RNA，設計特異性引物RT-PCR擴增Tsol18基因片段，并同義突變Tsol18基因片段中四個大腸桿菌低利用率密碼子，截去其N端的16個氨基酸的信號肽編碼序列，構建原核表達載體pGEX-4T-Tsol18并表達，進行GST-Tsol18重組蛋白的SDS-PAGE、Westernblot及穩(wěn)定性分析，并以GST-Tsol18重組蛋白為抗原制備兔高免血清；將改造的Tsol18基因片

5、段插入Asd+的組成型表達載體pYA3341，構建重組載體pYA3341-Tsol18，將重組載體電轉化入缺失腺苷酸環(huán)化酶(Δcya)、環(huán)腺苷酸受體蛋白基因(Δcrp)以及天冬氨酸-β-半醛脫氫酶(Δasd)的減毒鼠傷寒沙門氏菌X4550，研究重組活載體疫苗X4550(pYA3341-Tsol18)表達Tsol18重組蛋白的免疫原性、生長穩(wěn)定性、口服安全性及在小鼠體內的分布情況，ELISA檢測免疫小鼠血清和腸液中抗Tsol18抗體的產生

6、情況，流式細胞術分析其脾細胞亞型的分化，ELISA檢測免疫豬血清中抗Tsol18抗體的動態(tài)變化，探討重組疫苗可能的免疫應答。 結果顯示改造后的GST-Tsol18重組蛋白多以可溶性形式表達，蛋白表達量占菌體總蛋白的24％，Westernblot證明GST-Tsol18重組蛋白具有良好的抗原性，4℃保存120d只有20.1％降解，顯示重組蛋白穩(wěn)定性有很大改善。重組疫苗4550(pYA3341-Tsol18)在沒有選擇壓力的情況下連

7、續(xù)培養(yǎng)100代后，隨機挑選的重組疫苗株全部都能生長和表達Tsol18重組蛋白，表明重組疫苗生長穩(wěn)定；BALB/c鼠口服重組疫苗株2.0×1012cfu30天后，存活率100％，證實重組疫苗口服安全可靠，小鼠口服免疫后第21天在脾臟仍能測到大量的重組疫苗株，表明重組疫苗在體內能夠長久存活，有利于刺激機體產生持久的免疫應答；ELISA檢測顯示在二免后四周小鼠血清中抗Tsol18IgG抗體的OD值達到0.645，二免后六周小鼠腸液中有抗Tso

8、l18分泌性IgA抗體產生，表明重組疫苗能誘導小鼠產生較強的抗體水平和激發(fā)多種免疫應答方式；免疫小鼠的CD4+、CD8+T淋巴細胞數(shù)目明顯增多，CD4+/CD8+T細胞比值也顯著增高(P＜0.01)，提示口服疫苗4550(pYA3341-Tsol18)可能同時誘導Th1和Th2免疫應答反應。豬免疫后20d抗Tsol18IgG抗體水平開始上升，在二免后30天抗體OD值達到1.025，表明重組疫苗能誘導豬產生抗豬囊尾蚴病的免疫應答效應。